Co-immunoprecipitation analysmetod för att studera funktionella interaktioner mellan receptorer och enzymer
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för co-immunoprecipitation och en på-pärla enzymatisk aktivitet assay att samtidigt studera bidrag specifikt protein domäner av plasma membranreceptorer både enzym rekrytering och enzymaktivitet.
Abstract
Receptor-associerade enzymer är de stora medlarearna av cellulär aktivering. Dessa enzymer regleras, åtminstone delvis, fysiska interaktioner med cytoplasmiska svansar av receptorer. Samspelet ofta uppstå genom specifika protein domäner och leda till aktivering av enzymer. I området i närheten finns det flera metoder för att studera interaktioner mellan proteiner. Även co-immunoprecipitation används vanligen för att studera domäner som krävs för protein-protein interaktioner, finns inga analyser dokumentet specifika domäner till aktiviteten hos enzymerna som rekryterade bidrag samtidigt. Följaktligen kombinerar den metod som beskrivs här co-immunoprecipitation och på-pärla enzymaktivitet test för samtidig utvärdering av interaktioner mellan proteiner och associerade enzymatisk aktivering. Målet med detta protokoll är att identifiera de domäner som är kritiska för fysiska interaktioner mellan ett protein och enzym och domäner som är obligatoriska för slutföra aktiveringen av enzymet. Vikten av denna analys framgår, som vissa receptor protein domäner bidrar till bindningen av enzymet till cytoplasmiska svans av receptor, medan andra domäner är nödvändigt att reglera funktionen av samma enzym.
Introduction
Katalytisk receptorer och receptortyrosinkinaser är transmembrana proteiner som orsakar bindningen av en extracellulär ligand enzymatisk aktivitet på intracellulära sida1. Vissa receptorer besitter både receptor och enzymatiska funktioner, medan andra rekrytera specifika enzymer såsom kinaser och fosfataser till deras cytoplasmiska svansar. Rekrytering av ett enzym till receptorns tail och det efterföljande katalys av detta enzym är två separata processer som inte alltid regleras av samma protein domäner2. Tyvärr finns det inga särskilda verktyg för att bedöma både interaktion och enzymatisk aktivitet samtidigt. Funktionella co-immunoprecipitation analysen beskrivs här är en användbar metod att dissekera rekrytering av ett enzym till svansen på en receptor från dess aktivering. Denna analys använder tredjeparts immunoprecipitation av märkta receptorer av antikroppsbelagda pärlor. Därefter utförs både en enzymatisk aktivitet assay och western blot analys på pärlor. Det övergripande målet med denna metod är att avslöja vilka protein domäner är nödvändiga för interaktioner mellan receptorer och enzymer (bedömd med western blot analys) och vilka domäner är obligatoriska för fullständig aktivering av enzymer (mätt på-pärla enzymatisk aktivitet assay). Det är betydelsefullt att utveckla verktyg för att studera de separata funktionerna av receptor-associerade enzymer på grund av sin inblandning i patogenesen av mänskliga sjukdomar. Dessutom kan ytterligare förstå verkningsmekanismer av dessa proteiner hjälpa utformningen av nya terapeutiska interventioner.
Programmerad död-1 (PD-1) är en hämmande receptor på ytan av T-celler och krävs för att begränsa överdriven T-cell svar. Under de senaste åren har anti-PD-1 antikroppar varit inblandade i behandlingen av flera maligniteter1,2. PD-1 ligatur hindrar många T-cellfunktioner, inklusive spridning, adhesion och sekretion av flera cytokiner3,4,5. PD-1 är lokaliserad till immunologisk synaps, gränssnittet mellan T-celler och antigen-presenterande celler6, där det colocalizes med T-cells-receptorn (TCR)7. Därefter den tyrosin fosfatas SHP2 [Src homologi 2 (SH2) domänen som innehåller tyrosin fosfatas 2] rekryteras till den cytoplasmiska svansen av PD-1, vilket leder till dephosphorylation av nyckel tyrosin rester inom komplexa TCR och dess associerade proximala Signaling molekyler3,4,5,8,9. Den cytoplasmiska svansen av PD-1 innehåller två tyrosin motiv, en immunoreceptor tyrosin-baserade hämmande motiv (svart) och en immunoreceptor tyrosin baserat-switch motiv (ITSM)10. Både motiv är fosforyleras vid PD-1 ligatur9,10. Mutagenes studier har visat en primär roll i ITSM SHP2 rekrytering, i motsats till den svart, vars roll i PD-1 signalering och funktion inte är klart4.
SHP2 antar antingen ett stängt (flertrådigt), inhiberad konformation eller öppen (extended), aktiv konformation11. Bidraget från varje svans domän av PD-1 SHP2 bindande eller aktiveringen är ännu inte klarlagd. För att besvara den frågan har utvecklat vi en analysmetod som möjliggör parallella testning av rekrytering av SHP2 till svansen av PD-1 och dess aktivitet12. Vi anställd co-immunoprecipitation och en på-pärla fosfatas aktivitet assay att testa både interaktion och enzymatisk aktivitet parallellt. Med denna analys, visar vi att den ITSM av PD-1 är tillräcklig för att rekrytera SHP2 till svansen av PD-1, medan den svart av PD-1 krävs att fullt förlänga och aktivera enzymet.
I området i närheten finns det många receptorer som har flera intilliggande domäner i deras cytoplasmiska svansar. Funktionella co-immunoprecipitation analysen kan avslöja rollen av specifika domäner som är nödvändiga för antingen protein rekrytering eller enzymatisk aktivering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Receptor-enzym interaktioner är avgörande för Intracellulär signalering. Många enzymer rekryteras till receptorer genom SH2 domäner bindande till fosforylerade tyrosines som pryder svansar av samma receptorer. Men enzymer är ofta vikta till stängda inaktiva konformationer och aktiveringen kräver en conformationaländring11 som kan medlas av andra domäner i samma receptor. Analysen beskrivs här åtgärder interaktioner mellan receptorer, enzymer samt aktivitet induceras av dessa interakt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt har finansierats av NIH Grants 1R01AI125640-01 och reumatologi Research Foundation.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
Riferimenti
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
