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Bioingegneria

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

Published: February 01, 2019
doi:
10.3791/58444
, , , , , , ,
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory,University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology,Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine,Monash University

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Generation der kationischen Nanoliposomes, basiert auf der Methode der trocken-Film und eignet sich für die sichere und effiziente Bereitstellung von in-vitro- Boten-RNA transkribiert.

Abstract

Die Entwicklung der Boten-RNA (mRNA)-basierten Therapeutika für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten mehr und mehr an Bedeutung aufgrund der positiven wird Eigenschaften von in Vitro (IVT) mRNA transkribiert. Mit Hilfe von IVT mRNA kann die de-Novo -Synthese des gewünschten Proteins induziert werden, ohne den physiologischen Zustand der Zielzelle. Darüber hinaus kann Protein-Biosynthese durch die vorübergehende Wirkung der IVT mRNA exakt gesteuert werden.

Für die effiziente Transfektion von Zellen kann Nanoliposomes (NLps) eine sichere und effiziente Transportvehikel für therapeutische mRNA darstellen. Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur sicheren und effizienten kationischen NLps bestehend aus DC-Cholesterin und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (Schmiere) als Lieferung Vektor für IVT mRNA zu generieren. NLps haben eine definierte Größe, eine homogene Verteilung und eine hohe Komplexierung Kapazität und kann mit der trocken-Film-Methode erzeugt werden. Darüber hinaus präsentieren wir unterschiedliche Testsysteme zu analysieren, ihre Komplexierung und Transfektion Ähnlichkeit mit synthetischen verstärkt grünes fluoreszierendes Protein (eGFP) mRNA, sowie ihre Auswirkungen auf die Zellviabilität. Insgesamt bietet der vorgestellte Protokoll einen effektiven und sicheren Zugang für mRNA Komplexierung, die Weiterentwicklung und Verbesserung die Verwaltung des therapeutischen mRNA kann.

Introduction

Die Verwendung von modifizierten mRNA für therapeutische Anwendungen hat großes Potenzial in den letzten Jahren gezeigt. In Herz-Kreislauf-, Entzündungs- und monogenetischen Krankheiten, sowie bei der Entwicklung von Impfstoffen ist mRNA eine vielversprechende therapeutische Mittel1.

Protein-Ersatz-Therapie mit mRNA bietet mehrere Vorteile gegenüber der klassischen Gentherapie, die auf DNA-Transfektion in die Ziel-Zellen2basiert. Die mRNA-Funktion startet direkt in das Zytosol. Obwohl das Plasmid DNA (pDNA), ein Konstrukt der doppelsträngigen, Rundschreiben kann DNA mit einem Promotor-Region und die Sequenz eines Gens, die Codierung der therapeutische Protein3, auch Handlungen im Zytosol, es nur in Zellen aufzunehmen die Mitose durchlaufen zum Zeitpunkt der Transfektion. Dies reduziert die Anzahl von transfizierten Zellen im Gewebe1,4. Insbesondere ist die Transfektion von Geweben mit schwachen Mitose Aktivität, z. B. Herzzellen, schwieriges5. Im Gegensatz zu pDNA treten die Transfektion und Übersetzung von mRNA in mitotischen und nicht mitotischen Zellen im Gewebe1,6. Die virale Integration von DNA in das Wirtsgenom kann mit mutagenen Effekte oder Immunreaktionen7,8, aber nach der Transfektion von Zellen mit einer Protein-Codierung mRNA, die de-Novo -Synthese des gewünschten Proteins kommen. startet autonom9,10. Darüber hinaus kann die Proteinsynthese genau auf den Patienten müssen durch Einzeldosen, ohne zu stören das Genom und riskieren mutagenen Effekte11eingestellt werden. Das Immunsystem aktivierende Potential der synthetisch erzeugten mRNA konnte drastisch gesenkt werden, mithilfe von Pseudo-Uridin und 5′-Methylcytidine anstelle von Uridin und Cytidin12. Pseudo-Uridin modifizierte mRNA auch gezeigt hat, haben eine erhöhte biologische Stabilität und eine deutlich höhere translationale Kapazität13.

Um die vielversprechenden Eigenschaften der mRNA-basierte Therapie in der klinischen Anwendung profitieren zu können, ist es wichtig, ein geeignetes Fahrzeug für den Transport von mRNA in die Zelle zu schaffen. Dieses Fahrzeug sollte nicht toxischen Eigenschaften in Vitro und in Vivozu tragen, schützen die mRNA gegen Nuklease-Abbau und bieten ausreichend zelluläre Aufnahme für eine längere Verfügbarkeit und Übersetzung der mRNA14.

Zwischen allen möglichen Träger für in Vivo Drug-Delivery, wie Kohlenstoff-Nanoröhren, Quantenpunkte und Liposomen, letztere wurden studierte am meisten15,16. Liposomen sind Vesikel bestehend aus einer Lipid Bilayer10. Sie sind amphiphil mit einer hydrophoben und einen hydrophilen Teil, und durch die selbständige Anordnung dieser Moleküle ist eine kugelförmige Doppelschicht gebildeten17. Im Inneren der Liposomen können Therapeutika oder Drogen gekapselt und somit geschützt von enzymatischen Abbau18. Mit N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium-Chlorid (DOTMA)19, Liposomen [1,2-Bis (Oleoyloxy)-3-Propan (Trimethylammonio)] (DOTAP)20und Dioctadecylamidoglycylspermine (Hunde)21, oder DC-Cholesterin22, gut charakterisiert sind und häufig für zelluläre Transfektion mit DNA oder RNA.

Kationische Liposomen umfassen eine positiv geladene Lipid und einer ungeladenen Phospholipid-23. Transfektion durch kationische Liposomen gehört zu den am häufigsten verwendeten Methoden für den Transport von Nukleinsäuren in Zellen24,25. Die kationischen Lipid-Partikel bilden komplexe mit den negativ geladenen Phosphatgruppen in das Rückgrat der Nukleinsäure-Moleküle26. Diese sogenannten Lipoplexes befestigen Sie an der Oberfläche der Zellmembran und geben Sie die Zelle durch Endozytose oder Endozytose ähnliche Mechanismen27.

Im Jahr 1989 Malone Et Al. erfolgreich beschrieben kationischen Lipid-mediated mRNA Transfektion28. Jedoch fand mit einer Mischung von DOTMA und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (Schmiere), die Gruppe, dass DOTMA zytotoxische Effekte28manifestiert. Zohra Et Al. zeigten darüber hinaus, dass DOTAP (1,2-Dioleoyloxy-3-Trimethylammonium-Propan-Chlorid) als ein mRNA Transfektion Reagenz29genutzt werden kann. Allerdings sollte für die effiziente Transfektion von Zellen, DOTAP in Kombination mit anderen Reagenzien, wie Fibronektin29 oder Schmiere30verwendet werden. Bisher wurde DOTMA die erste kationische Lipid auf dem Markt für die gen-Lieferung-31verwendet. Andere Fette dienen als therapeutische Träger oder in verschiedenen Phasen der klinischen Studien getestet (z. B. EndoTAG-I, mit DOTAP als Lipid-Carrier), wird derzeit in einer Phase-II-klinische Studie32untersucht.

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Generation des NLps mit DC-Cholesterin und Schmiere. Diese Methode ist einfach durchzuführen und ermöglicht die Erzeugung von NLps in verschiedenen Größen. Das allgemeine Ziel der NLp-Generation mit der trocken-Film-Methode ist die Schaffung von Liposomen für mRNA Komplexierung, wodurch effizient und biokompatible Zelle Transfektion in-vitro-14,33.

Protocol

1. Generation der kationischen Nanoliposomes (Abbildung 1) Lösen Sie die Lipide DC-Cholesterin (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-Carbamoylproxyl] Cholesterin Hydrochlorid) und Schmiere (Dioleoyl Phosphatidylethanolamine), geliefert als Pulver, in Chloroform, eine Endkonzentration von 25 mg/mL zu erreichen.Hinweis: Bewahren Sie die gelösten Lipide bei-20 ° C. Arbeiten Sie mit 25 mg/mL Stammlösung sowohl Lipide. Mix-40 µL der gelösten DC-Cholesterin und 80 ?…

Representative Results

Unter Verwendung des Protokolls wie beschrieben, wurden NLps bestehend aus den Lipiden DC-Cholesterin und Schmiere vorbereitet mit der trocken-Film-Methode (Abbildung 1). Während der Vorbereitung zeigt die Nanoliposome Lösung verschiedene Stufen der Trübung (Abbildung 2). Die Kapselung Wirksamkeit des NLps kann dann nach der Kapselung von 1 µg eGFP-Codierung mRNA an…

Discussion

Die vorgestellte Protokoll beschreibt die Generation des NLps mit hohen Kapselung Wirksamkeit für synthetisch veränderte mRNA, sowie die zuverlässige Transfektion von Zellen in Vitro. Darüber hinaus garantieren die NLps die Freisetzung von mRNA, die wiederum in ein funktionsfähiges Protein in der Zelle übersetzt ist. Zusätzlich die Transfektionen mit NLps in regelmäßige Zelle Medium durchgeführt werden kann, was zu hohen Zelle künstliche während Transfektion, und dauern bis zu drei Tage nach Transfek…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Keine

Materials

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766
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Michel, T., Link, A., Abraham, M., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).
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