Immunisering av vuxen zebrafiskar för prekliniska Screening av DNA-baserad vacciner

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för immunisering av de vuxna zebrafiskar (Danio rerio) med DNA-baserad vaccin och Visa validering av en lyckad vaccination händelse. Denna metod är lämplig för den prekliniska screeningen av vaccinkandidater i olika infektion modeller.

Abstract

Intresset för DNA-baserade vaccination har ökat under de senaste två decennierna. DNA vaccination är baserad på kloning av en sekvens av en valda antigen eller en kombination av antigener i en plasmid, som möjliggör en skräddarsydd och säker design. Förvaltning av DNA-vaccin till värdceller leder till uttrycket av antigener som stimulerar både humorala och cellmedierade immunsvaret. Denna rapport beskriver ett protokoll för kloning av antigen sekvenser i pCMV-andra plasmiden, immunisering av vuxen zebrafiskar med vaccinkandidater genom intramuskulär Mikroskop och den efterföljande elektroporation att förbättra intaget. Vaccinantigen uttrycks som grönt fluorescerande protein (GFP)-fusionsproteiner, vilket gör att bekräftelsen av antigen uttrycket under UV-ljus från levande fisk och kvantifiering av uttrycksnivåerna för fusionsprotein med ELISA, såväl som deras upptäckt med en western blot-analys. Den skyddande effekten av vaccinet kandidaterna testas genom att infektera fisken med Mycobacterium marinum fem veckor efter vaccination, följt av kvantifiering av bakterierna med qPCR fyra veckor senare. Denna metod jämfört med däggdjur prekliniska screening modeller, och ger en kostnadseffektiv metod för preliminära screening av romanen DNA-baserade vaccinkandidater mot en mykobakteriella infektioner. Metoden kan tillämpas ytterligare till screening DNA-baserade vacciner mot olika bakteriella och virala sjukdomar.

Introduction

De första DNA-vaccin studierna utfördes på 1990-talet¹, och sedan dess har DNA-vaccin testats mot olika infektionssjukdomar, cancer, autoimmunitet och allergi². Hos däggdjur, ett DNA-vaccin mot West Nile-virus i hästar och ett terapeutiskt cancervaccin för hundarnas muntliga malignt melanom har licensierats, men dessa är inte närvarande i klinisk användning². Förutom det intresse som frammanade av däggdjur studier, har DNA vaccination visat sig vara ett bekvämt sätt att vaccinera odlad fisk mot virussjukdomar. Ett vaccin mot fisk infektiös hematopoetisk nekros virus (IHNV) har använts kommersiellt sedan 2005, och ett vaccin mot infektiös pankreasnekros virus (IPNV) var nyligen licensierade³. Dessutom utvecklas flera DNA-vaccin mot fisk patogener.

Som traditionella vacciner innehåller ofta inaktiverade eller levande försvagade smittämnen, utgör de en potentiell risk för överföring av sjukdomen². DNA-vaccin, i sin tur avvärja denna risk, eftersom de bygger på administrationen av Plasmiden kodning bakteriella eller virala antigener, snarare än hela patogenen själv^2,4. DNA-vaccin tillverkas med DNA rekombination tekniker, vilket gör den exakta utformningen av vaccinantigen och flexibla utformningen av antigen kombinationer och tillsatser i ett enda vaccin konstruera⁵. Dessutom är produktionen av DNA-vaccin snabbare, enklare och mer kostnadseffektiv än protein-baserade rekombinant vaccin, som är en stor fördel för vaccinkandidat screening ändamål, men också, till exempel vid pandemiskt utbrott ².

I fisk, de vanligaste administreringsvägar för DNA-vaccin är intraperitoneal, intramuskulär och muntliga^3,6,7, medan hos däggdjur, subkutan och intrakutana rutter är ytterligare alternativ². Efter en intramuskulär injektion, administreras DNA plasmidsna in i cellerna på administrationswebbplatsen (t.ex., mestadels myocyter, men också bosatt antigen-presenterande celler [trupptransportfordon]). Andelen transfekterade celler kan ökas betydligt genom elektroporation^2,8. Efter in i cellen, in vissa plasmid DNA i kärnan, där de gener som kodas av Plasmiden är transkriberade². I detta protokoll använder vi pCMV-andra plasmiden som har en stark allestädes närvarande promotor optimerad för eukaryota uttryck⁹. I denna konstruktion översätts antigenerna som ett fusionsprotein med en god Jordbrukarsed. GFP kan bekräftelsen av en lyckad vaccination och produktens rätta antigen genom enkel visualisering av antigen uttryck med fluorescens Mikroskop i levande fisk.

Hos däggdjur, har DNA-vaccin visat sig stimulera olika typer av immunsvar beroende på transfekterade cell typer^2,5. Transfekterade myocyter utsöndrar antigener i extracellulära eller släppa dem vid celldöd och de antigener som uppslukas av trupptransportfordon, presenteras därefter på stora histocompatibility komplex II molekyler². Detta utlöser CD4 och CD8 T cell svar, speciellt, förutom B-cell svar^2,5,10. I fisk, har T- och B-lymfocyter, liksom dendritiska celler (DCs), identifierats, men deras arbetsfördelning i antigen-presentation är mindre väl förstått¹¹. Zebrafiskar DCs, har dock visat att dela bevarade fenotypiska och funktionella egenskaper med deras däggdjur motsvarigheter¹². Dessutom har DNA vaccination visat sig framkalla liknande immunsvar i fisk och däggdjur, inklusive T- och B-cell svar^{6,13,14,15,16} .

Både larver och vuxna zebrafiskar används allmänt till modell olika infektionssjukdomar, till exempel fisk M. marinum infektion modell av tuberkulos som används i detta protokoll^{17,18,19,20 ,21,22}. I jämförelse med däggdjur modellorganismer, fördelarna med zebrafiskar inkluderar deras liten storlek, snabb reproducerbarhet och låg bostäder kostnader²³. Dessa aspekter gör att zebrafiskar en idealisk djurmodell för storskaliga prekliniska screening studier för nya vacciner och läkemedelssubstanser^23,24,25.

I detta protokoll beskriver vi hur romanen vaccine antigen kandidater mot mycobacteriosis kan utvärderas med DNA-baserad vaccination av vuxna zebrafiskar. Först beskriver vi hur antigener är klonade in pCMV-andra uttryck plasmiden, följt av ett detaljerat protokoll för intramuskulär injektion av vaccin plasmider och den efterföljande elektroporation i muskel. Ett uttryck för varje antigen bekräftas av fluorescence mikroskopi veckas postimmunization. Effekten av antigen kandidaterna testas sedan genom att experimentellt infektera vaccinerade fisk med M. marinum.

Protocol

Experiment inklusive vuxna zebrafiskar kräver en tillåtelse för djurförsök för både vaccination och de efterföljande studierna med infektion-modellen. Alla metoder och experiment som beskrivs här är godkända av de djur Experiment styrelsen i Finland (ESAVI) och studierna utförs i enlighet med EU-direktiv 2010/63/EU. 1. kloning av DNA vaccinantigen Välj ett uttryck plasmid optimerad av eukaryota uttryck för antigenfrekvensen sevärdheter under en stark, konstitutiva promotorn, såsom cytomegalovirus (CMV) omedelbara tidiga arrangören. I vivo kontrollen av antigen uttrycket, markera en vaccin plasmid som kodar en fluorescerande etikett, t ex pCMV-andra plasmid9 används i detta protokoll. Använd lämpliga webbaserade och bioinformatiska verktyg för att välja en potentiellt immun-skyddande antigen sekvens (eller flera sekvenser) av ungefärligt 90 – 600 nt (30 – 200 aa)26 från gene(s)-av-intressera av den patogen som ska användas i den efterföljande infektion modell. Använda tillgänglig programvara, eller manuellt design grundfärger att förstärka antigen generna från patogen genomet och att klona den antigen sekvens till webbplatsen multipel-kloning av uttrycket Plasmiden. Se till att bevara den korrekta läsning ram när du väljer antigenet. Inkludera både en Kozak sekvens (CCACC)27 och ett start-kodon (ATG) i 5′ primer. För att bevara C-terminal andra taggen, undvika mellanliggande stop-kodon (TAG, TAA, TGA) i sekvensen antigen och primern 3′. Kontrollera också att taggen GFP förblir i samma läsning ram med antigenet sevärdheter. Använda RNA eller DNA extraheras från patogenen som en mall för att generera en tillräcklig mängd PCR-produkt med kloning primers. Helst använda en korrekturläsning DNA-polymeras för att bevara den rätta antigen sekvensen. Rena PCR-produkten och kontrollera den rätta storleken på produkten med gelelektrofores. Smälta och ligera PCR-produkten med smält vaccin Plasmiden. Omvandla ligering mixen till behöriga bakterieceller enligt en lämplig protokoll. Använd ett lämpligt antibiotikum val för positiva kolonier och plasmid produktion i E. coli; pCMV-andra plasmiden, innehåller till exempel en genen för ampicillin-resistens för detta. Använda Sanger sekvensering att bekräfta insättning av sekvensen rätt antigen. Följande grundfärger kan användas för sekvensering antigener i pCMV-andra plasmiden: CMV framåt 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 ‘och andra-N bakåt 5′ CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’. Producera och rena en tillräcklig mängd av den vaccin konstruktion. Lös eller eluera plasmiden i sterilt vatten. Kontrollera att den producerade plasmid-DNA är av hög kvalitet och koncentrationen är minst 0.72 µM eller 2 000 ng/µL. 2. Dra Mikroskop nålar Förbereda Mikroskop nålar i förväg. Använd 10-cm aluminiumsilikat glas kapillärer. Observera att borosilikatglas kapillärer är alltför skör för att injicera vuxen fisk. Dra nålar med en mikropipett-nål-fabricera enhet.Obs: Nålar bör likna den som presenteras i figur 1. Med den enhet som används i detta protokoll (Tabell för material), resultat följande inställningar i den önskvärda typ av nålar: Ställ glaset kapillär i V-spår i baren avdragare och dra fastspänning vredet lätt. Flytta innehavaren bredvid glödtråden och tryck försiktigt kapillären genom glödtråden till avdragare baren på andra sidan av glödtråden. Undvik att vidröra glödtråden med kapillären. Dra åt fastspänning vreden, fastställs säkerhetsglaset och tryck på knappen dra.Varning: Glödtråden är heta. Placera nålar på en bit av återanvändbara lim inuti en 15 cm petriskål tallrik att skydda nålen tips. Hålla skålen omfattas för att hålla nålar rent. 3. fyllning mikropipett nålar Förbereda vaccin mixen. Använd 0,5 – 12 µg av Plasmiden per dos. Om att kombinera flera olika plasmider i en vaccination mix, använda en högsta totala DNA-koncentrationen av 12 µg per fisk. Beräkna volymen av vaccinet ”master mix” enligt antalet fiskar i varje grupp (se nedan). Lägga till 1 µl sterilt-filtrerad fenolrött till varje injektion dos att lindra både fyllning av kapillär nålar och observation av injektionen. Lägg till sterila 1 x PBS upp till en maximal total volym på 5 – 7 µl i en injektion dos8.Obs: Injektionsvolymer högre än 7 µL kan resultera i tillfällig läckage av injektionslösningen och bör därför undvikas. Placera en bit tejp, lim sida upp, på en lämplig hållare, exempelvis sidan av en tom tip-låda. Försiktigt bifoga kapillär nålar på band. Pipettera högst 7 µL av vaccin blandningen på en bit av laboratoriet film. Använder en lastning spets, överföra vaccinet från filmen i nålen. Pipettera långsamt och försiktigt, undvika pipettering luftbubblor in nålen. Låt nålarna nöja sig med 15 – 30 min att ta bort eventuella återstående små luftbubblor. 4. ställa in Microinjector och Electroporator för immunisering In i micromanipulator och en ljuskälla i rätt position. Byta luft trycket kranen till öppet läge. Justera parametrarna för den pneumatisk pump (se även figur 2) som följer. Ställ in vredet i vent på Eject port att hålla att förhindra återfyllning av pipetten genom kapillärkraft. Ange slangar från eject port till mikropipett. Använd inte vakuum hamnen i detta protokoll. Justera puls längd: använda den tidsinställda läge, där en elektronisk timer styr hela tiden pressar solenoiden förblir öppen. Kontrollera att den gröna lampan bredvid utmatningsknappen tryckmätaren tänds när trycket solenoiden är öppna (strömförande). Ställa in puls intervall till 10 s; med den här inställningen pulserna kan ytterligare anges från 100 ms till 10,1 s. användning den 10-sväng period ringa för finjusterande puls längd — varje tur på ratten är 1,0 s. Om det behövs, kan detta också justeras under en injektion. Använda puls initiativtagare (”start button”) på framsidan av pneumatiska pumpen, eller en remote foot switch (rekommenderas). Detta är ansluten till den främre panelen av pneumatisk pump. Ställ på injektionsnålen på mikropipett innehavaren av micromanipulator. Skär spetsen av nålen med pincett så att vätskan kan tryckas ut, och använda Mikroskop för att visa korrekt position. Tryck på fotströmställaren en gång för att se att en 1-s puls skjuter en liten droppe ur nålen. Använd följande inställningar för den electroporator: spänning = 40 V. puls längd = 50 ms, antal pulser = 6. Anslut pincetten till electroporator. Se att den faktiska spänningen och puls längd visas på monitorn inte skiljer sig avsevärt från inställningar. 5. injektion av DNA-vaccin och elektroporation För vaccinationer enligt detta protokoll, använda friska, 6 till 12 månader gamla vuxna zebrafiskar. Förvara fisken i en genomströmmande system med en 14/10 h ljus/mörk cykel, med högst sju fiskar per 1 L vatten. Förbereda en 0.02% 3-aminobensoesyra acid ethyl ester (tricaine) lösning (pH 7) i tank vatten för anesthetizing den fisk28. Använd en 10 cm petriskål eller något liknande. Förbereda en återhämtning tank genom att fylla en 5 L bägare med 3 L ren system vatten. Förbereda en vaccination stoppning för att hålla fisken i en fast position under vaccination. Ta en 5 x 7 cm2 bit av en 2 till 3 cm tjock svamp. Skär en skåra i svampen med en skalpell blad eller vassa saxar.Obs: Samma vaccination Stoppningen kan användas i flera experiment. Desinficera svampen mellan experiment genom att blötlägga den i 70% etylalkohol och låt torka. Blötlägg svampen i systemets vatten och Ställ svampen på en petriskål noggrant. Snabb fisk 24 h innan vaccinationer. Söva en zebrafisk genom att placera den på en petriskål som innehåller 0,02% tricaine. Vänta tills fisken inte svarar röra stimulering och tills ingen rörelse av gälarna. Söva en enda fisk i taget. Använda en plastsked, överföra den sövda zebrafiskar på våta svampen och ange fiskens ventrala sida i skåran. I rätt position, se till att huvudet och de flesta av kroppen av fisken släpper spåret och ryggfenan och svansen sticker ut från spåret. Under mikroskopet, noggrant placera nålen i en ca 45° vinkel nära den zebrafiskar dorsala muskel, med hjälp av x – och y – axeln finjusterande hjul på micromanipulator. Hitta små plats utan våg framför ryggfenan, där trycker in nålen inte kräver kraft. Om motstånd känns, prova en närliggande plats. Undvik skadade ryggraden, ryggfenan eller skalor.Obs: Om nålen böjs medan du trycker, förkorta nålen något genom att skära den. Använd fotpedalen för att gradvis injicera vaccinet lösningen i muskeln. Observera injektionen genom mikroskopet: fenolrött syns som det går in i muskelvävnaden. Justera längden på pulsen om det behövs.Obs: Alternativt använda puls initieraren knappen på framsidan av pneumatisk pump för injektion. Dock tillåter användning av en fjärransluten fotpedal med den andra handen för att justera puls längd av 10-sväng ratten ratten. Undvik att injicera lösningen för fort, eftersom detta kan orsaka överdriven vävnadsskada. Se till att inte injicera någon luft. Electroporate fisken omedelbart efter injektionen. Kontrollera att fisken är fortfarande under narkos. Håll fisken på svampen och in fisken mellan tweezer-typ elektroder, så att elektroderna är placerade på vardera sidan av injektionsstället. Tryck inte på elektroden pincetten för hårt men hålla båda elektroderna i kontakt med fisken. Tryck på startknappen på electroporator att ge sex 40 V, 50 ms pulser. Försiktigt överför fisken till återhämtning tank. Ren elektroderna efter varje elektroporation genom att dra dem med 70% etanol.Obs: Noggrant övervaka wellen-being av fisken efter vaccinationen. Avliva någon fisk som visar tecken på obehag (en långsam återhämtning från anestesi, avvikande simning, kippar) i 0,04% tricaine. Efter återhämtning, överföra fisken till enheten genomflöde och mata den normalt. 6. visualisering och avbildning av Antigen uttryck Söva fisken i 0,02% tricaine 2 – 7 dagar efter immunisering och använda ett UV-ljus för att se andra uttryck nära injektionsstället.Obs: Okulärbesiktning under en UV-lampa är en lätt och icke-invasiv åtgärd som är lämplig för rutinmässig kontroll av framgångsrika vaccinationer, också i storskaliga experiment. Om inga bilder av fisk krävs, kan detta steg även utföras i vanlig fisketankar utan att behöva söva eller flytta fisken. För att fånga bilder, använda fluorescens Mikroskop för att visualisera andra uttryck på injektion plats8. Använd en 2 X-objektiv och välj filtret rätt att visualisera fluorescens eller synliga ljus visningar. Hålla den sövda fisken fortfarande genom att trycka på den ventrala fin försiktigt med pincett en petriskål nedre delen. Ta både tända-mikroskopet och fluorescens bilder av samma område. Sammanfoga tända-mikroskopet och fluorescens bilderna med lämplig programvara29. Lägga till en skalstapeln. 7. kvantifiering av uttrycket nivå och storlek av antigener Avliva fisken i 0,04% tricaine. Dissekera den fluorescerande delen av dorsala muskeln med en skalpell och pincett under UV-ljus. Extrahera proteiner från prover8. Kontrollera rätt storlek av in vivo-producerade proteiner med en western blot-analys, med en pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad GFP antikropp (eller liknande)8. Inkludera en negativ kontroll (unimmunized fisk) för att utesluta någon bakgrund signaler och ospecifik bindning, tillsammans med en kontroll som uttrycker andra utan ett smält antigen.Obs: För western blot analys, den förvänta storleken (i kDa) av antigen-fusionsproteinerna kan beräknas, till exempel genom ekvationen:Molekylvikt (MW) av dsDNA = (antal nukleotider x 607,4) + 157,9; eller genom att använda webbaserade verktyg. Kvantifiera ett uttryck för varje antigen som använder en GFP-ELISA8 (valfritt). 8. kombinera protokollet Vaccination med en M. marinum infektion modell Bestämma gruppstorleken på som krävs för tillförlitlig bestämning av effektiviteten av en roman vaccinkandidat i infektion-modellen och analysen används (se, exempelvis, Myllymäki et al. 24 och Charan och Kantharia30). Genomföra de lämpliga styrkeberäkningar även planering experimenten. För att utvärdera effektiviteten av vaccinkandidater, infektera den fisk 5 veckor postimmunization. Använda en intraperitoneal infektion med cirka 30 kolonibildande enheter (cfu) av M. marinum, som leder till en latent infektion i de flesta fiskar8,20,31.Obs: När du använder M. marinum, Följ ett BSL2 säkerhet protokoll. Utarbetandet av den bakterie eller virus beror på patogenen. Kvantifiera antalet patogener i varje fisk. Avliva den fisk 4 veckor angripen och bestämma bakteriell bördan i varje fisk från de extraherat DNA med qPCR med primers som är specifika för M. marinum20,24.Obs: Glöm inte att inkludera en lämplig kontrollgrupp och Använd de rätta statistiska metoderna för att analysera resultaten. En grupp av fisk som immuniserats med tomma pCMV-andra plasmiden är i allmänhet en lämplig negativ kontroll. Bekräfta positiva resultat med antigener utan taggen GFP. Klona antigenerna som beskrivs i steg 1 och upprepa vaccinationen experimentet.

Representative Results

De olika stegen i protokollet DNA vaccination av vuxna zebrafiskar illustreras i figur 3. Först, de valda antigen sekvenserna är klonade in en pCMV-andra plasmid och plasmid DNA produceras och renat24 (figur 3). Vaccinkandidater sedan injiceras intramuskulärt med en microinjector och injektionsstället är electroporated att förbättra intaget av Plasmiden i celler (figur 3). Används vaccination dosen var optimerad genom att injicera olika mängder pCMV-andra plasmiden och mäta GFP uttrycket med ELISA (tilläggs figur 1). Två till sju dagar efter vaccination, uttrycket av proteinet fusion upptäcks under UV-ljus och visualiseras med fluorescensmikroskopi (figur 3 och figur 4). Uttrycksnivåerna av olika antigener kan variera från mycket intensiv (antigen 1) till en svag uttryck (figur 4). Dessutom god Jordbrukarsed uttryck kan observeras över dorsala muskeln (antigen 1), eller i ett mer begränsat område (antigen 2) (figur 4). Om ingen fluorescens upptäcks inom 10 dagar, rekommenderas det dock att se till att det finns inga misstag i antigen kloning eller primer design. För att bekräfta att de uttryckt fusionsprotein är av rätt storlek, kan proteiner extraheras från muskelvävnaden runt injektionsstället och användas för en western blot-analys. Effekten av vaccinkandidater utvärderas av utmanande fisken med en låg dos av M. marinum genom en intraperitoneal injektion (figur 5). Fyra till fem veckor angripen, bakteriell räkningarna bestäms med qPCR och jämfört bakteriell laster i kontrollgruppen (figur 5). Dessutom effektiviteten av de mest lovande vaccinkandidater kan testas genom att övervaka överlevnad efter en hög dos M. marinum infektion()figur 5). Men förutom att ge ett kvantitativa resultat på progression av infektionen, i stället för bara en status av levande eller döda, qPCR-baserade cfu kvantifiering kräver mindre tid och mindre grupp storlekar och är därför ett mer etiskt förhållningssätt för en primär skärmen. Sammantaget underlättar detta protokoll screening av romanen vaccinantigen effektivitet inom 12 veckor (figur 5). Figur 1: Närbild (12 X) av aluminiumsilikat nålar används i vuxen zebrafiskar intra muskulär injektionerna. Spets nedan har skurits med pincett och är redo att användas för microinjections. Denna siffra har anpassats från Oksanen35. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: Mikroskop utrustning och set-up. De viktigaste komponenterna i den utrustning som behövs för DNA vaccination av vuxna zebrafiskar är markerade med fetstil. De kritiska justeringarna indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: förbereda de DNA-vaccin plasmidsna och förfarandet för immunisering. (1), valda antigener klonade intilliggande i GFP-taggen i pCMV-andra Plasmiden. (2), vaccinet konstruktion är producerade mikrobiologiskt, koncentrerad och renad. (3), 12 µg av Plasmiden injiceras i en sövda vuxen zebrafiskar med en microinjector dorsala muskeln och injektionsstället är därefter electroporated med sex 40-V, 50-ms pulser. (4) två till sju dagar efter vaccination, GFP uttrycket av proteinet antigen-GFP fusion är visualiseras med fluorescens Mikroskop. (5) fluorescerande del av dorsala muskeln kan dissekeras och användas för protein utvinning. Storleken på fusionsprotein bekräftas med en western blot-analys och uttryck med GFP-ELISA. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4: visualisera uttrycket av proteinet antigen-andra fusion. Sövda vuxen zebrafiskar är vaccinerade med 12 µg av experimentella vaccinantigen (antigen 1 – 3) och injektionsstället är electroporated, därefter med sex 40 V, 50 ms pulser. Två till sju dagar efter vaccination, injektionsstället är avbildade med ett mikroskop. Först, ett uttryck för god Jordbrukarsed upptäcks i fluorescens Mikroskop. Området inspekteras med en 2 X magnitud målsättningen och avbildats och sparas i TIFF form. Ljusmikroskop bilden av samma område är samman med fluorescens bilden med hjälp av programmet ImageJ. Kvantitet och position av antigen uttrycket variera mellan antigener och individuella fiskar. Till exempel uttrycket av antigen 1 observeras över dorsala muskeln och uttrycket av antigen 2 ses som små fläckar, antigen 3 är starkt uttryckt i ett mer begränsat område. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: tester av hur ändamålsenliga vaccinkandidater mot en mykobakteriella infektioner. (1) vuxen zebrafiskar är vaccinerade med experimentella DNA-vaccin mot mycobacteriosis. (2) fem veckor efter vaccination, fisken är infekterade med en låg dos av Mycobacterium marinum (~ 30 cfu). (3), fyra veckor senare, den inre organ är dissekeras och används för DNA-extraktion. (4), bakteriell greven i varje fisk kvantifieras med qPCR med M. marinum-specifika primers. Immunisering med antigen 1 ledde till en signifikant minskning av bakteriell räkningarna (p < 0,01, tvåvägs ANOVA), medan antigener 2 och 3 hade ingen effekt. (5) skyddande effekten av de mest lovande vaccinkandidat (antigen 1) utvärderas ytterligare i en överlevnad experiment, där fisk är infekterade med en hög dos (~ 10 000 cfu) av bakterier och deras överlevnad är övervakas för 12 veckor. I enlighet med minskningen av den bakteriella bördan observerats i panelen 4, vaccination med antigen 1 också förbättrat överlevnaden av fisken på en M. marinum infektion (p < 0,01), vilket tyder på detta antigen kan vara en lovande kandidat för ett nytt vaccin mot tuberkulos. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Kompletterande Figur1: belopp av plasmid DNA påverkar plasmid-derived andra uttryck i vuxen zebrafiskar. Grupper av fisk (n = 5 i varje grupp) injicerades med 0,5 – 20 μg av pCMV-andra, och elektroporation (sex pulser av 50 V) användes för att förbättra transfection. Kontroll fisk (CTRL) injicerades med 2 μg av Tom pCMV plasmiden som inte innehåller andra genen. GFP-ELISA var utförda 3 dagar postinjection att definiera relativ andra uttrycket i fisk homogenates. P-värden: *p < 0,03, **p < 0,004. Felstaplar representera standardavvikelser. NS = inte betydande. Denna siffra har anpassats från Oksanen35. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Tillvägagångssättet av immuniseringsämnet vuxen zebrafiskar med DNA-baserad vacciner kräver viss teknisk expertis. Även för en erfaren forskare tar vaccinera en enda fisk ca 3 min, exklusive preparat. Således kan maximalt ungefär 100 fisk vara immuniserade inom en dag. Om mer än 100 fisk krävs för experimentet kan immunizations delas mellan upp till 3 dagar. Förutom kvaliteten på experimentet är tillräcklig utbildning för Tillträdeskriterier för hantering av fisken och utföra immunisering viktigt för välbefinnandet hos fisken. Se till att följa lokala rättsliga och djurskydd regler och riktlinjer när det gäller bostäder fisken, planera experiment, och de kvalifikationer som krävs för de personal som utför experiment.

Sammanfattningsvis finns det flera kritiska steg för att undvika komplikationer i protokollet immunisering. För framgångsrika immunisering, se till att 1) fisken till vara immuniserats är friska och tillräcklig ålder och storlek (immunisering av mer ungfisk kan kräva ner skalning vaccin volymen och elektroporation inställningar); 2) fisken bedövas ordentligt med ingen starkare än 0,02% 3-aminobensoesyra acid ethyl ester, och de förblir sövda under hela förfarandet (anestesi bör hållas så kort som möjligt för att säkerställa indrivning av fisk); 3) svamp pad är ordentligt blöt; 4) vätska injiceras i varje puls från pneumatiska pumpen och, om inte, puls längd justeras (dra nålen något bakåt längs y-axeln kan hjälpa); 5) det finns inga luftbubblor med vaccin lösningen; 6) elektroporation inställningarna och faktiska puls spänning och längd är korrekt. 7) elektroderna inte orsakar hudskador på webbplatsen elektroporation (under elektroporation, hålla elektroderna i mild kontakt med fisken, och släppa fisken omedelbart in i recovery tanken efter elektroporation).

Det är viktigt att övervaka fisken efter elektroporation i återhämtning tanken och att avliva en fisk som visar tecken på obehag. Det är vidare nödvändigt att öva proceduren innan du börjar ett storskaligt experiment, för att säkerställa ett flytande arbetsflöde. Om möjligt, be en tillräckligt utbildade kollega för hjälp med att fylla nålar och elektroporation.

Metoden DNA vaccination kan den skräddarsydda designen av vaccinantigen. Det är möjligt att klona hela antigen eller, helst, markera delar av antigenet baserat på cellulär lokalisering och immunogenicitet²⁴. Dessutom kan metoden att kombinera flera antigener eller tillsatsmedel till en vaccindos konstruera eller injicera flera separata plasmider vid samma tid². Genom bland annat ett stop-kodon efter sekvensen antigen eller excising den andra genen från plasmiden, är det möjligt att utnyttja samma plasmid vektorn också för att uttrycka antigenen utan efterföljande N-terminala GFP etiketten. Detta kan vara rimliga för att bekräfta resultaten positiv screening, som GFP relativt stora storlek kan påverka vikningen av antigenet och, därmed, begränsa humorala svar potentiellt frammanade med vaccination.

Ett högre antigen uttryck har kopplats till DNA vaccin immunogenicitet². Elektroporation efter injektion, således tagits med i detta protokoll, eftersom det har visat sig öka uttrycket av antigener eller reporter gener från fyrfaldigt till tiofaldigt i zebrafiskar³². Dessutom orsakar elektroporation som en teknik måttlig vävnadsskada, således framkalla lokal inflammation som ytterligare främjar de vaccininducerade immunsvar². Däremot, tolereras elektroporation generellt väl. Med den utrustning som används här, praktiskt taget 100% av vuxen zebrafiskar kommer att återhämta sig väl från sex pulserna 40 V används i detta protokoll³⁵.

Förutom att använda elektroporation för att förbättra införandet av vaccinet plasmiden in i cellerna, använder vi en stark allestädes närvarande promotor i vaccin plasmiden och polyA svans slutet 3′ av antigenet för att förbättra antigen uttryck i transfekterade fisk cellerna. I vissa fall om kodon användningen av target patogenen avsevärt skiljer sig från de vaccinerade arterna, har kodon optimering visat sig användbara i ytterligare öka målet gene expression². I denna zebrafisk –M. marinum modell, dock kodon optimering hade ingen signifikant effekt på uttrycket nivåer av två mykobakteriella modell gener, ESAT-6 och CFP-10, och har således ansetts onödigt i denna modell³⁵ .

Målprofiler gen uttryck har viss tidsmässig variation mellan antigenerna, exempelvis beroende på storleken och strukturen av antigener i fråga. Antigen uttryck är dock oftast liknande inom en grupp av fiskar som immuniserats med samma vaccin. Vanligtvis det ljusaste andra uttrycket observeras fyra dagar till en vecka efter vaccination, men en skala på 2 – 10 dagar är möjligt. Det rekommenderas att validera ett uttryck för varje antigen-andra fusionsprotein i en liten grupp av fisk (2 – 3) innan antigen i ett storskaligt experiment. Om ingen GFP uttryck observeras vid något tillfälle 2 – 10 dagar efter immunisering, se till att 1) protokollet immunisering följdes noga. Alltid har en grupp av fiskar som immuniserats med tomma pCMV-andra plasmiden som positiv kontroll och se till att 2) antigen design och molekylär kloning genomfördes korrekt (adekvat primer design; antigenet och andra taggen är båda i samma behandlingen ram och inga mellanliggande stop kodon ingår). I vissa fall, trots den rätta antigen designen, kan GFP inte identifieras. Detta kan bero på den felaktiga vikning eller snabb nedbrytning av proteinet fusion. Under dessa omständigheter kan det vara nödvändigt att omforma antigenet.

I vacciner som används för att vaccinera odlad fisk, är den plasmid dosen som används typiskt 1 µg eller mindre^7,33,34. I zebrafiskar, kan reporter genuttryck också upptäckas efter minst en 0.5 µg plasmid injektion efter elektroporation; dock ökar relativt mål genuttrycket markant med en högre mängd plasmiden per fisk (kompletterande Figur1). Fisk injiceras med pCMV-andra reporter plasmiden, resulterade en injektion med 5-20 µg av Plasmiden i fyra till åtta gånger högre andra nivåer jämfört med fisk injiceras med 0,5 µg. Därför, för att säkerställa en tillräckligt hög mål genuttryck, men ändå ha injektionsvolymer som är liten nog (≤7 µL) för att förhindra överflödig vävnad eller vaccin läckage, valde vi att använda 5 till 12 µg per fisk för att preliminär screening. Förutom vaccin immunogenicitet, en hög nog målet genuttryck krävs att upptäcka reporter genuttryck med fluorescens Mikroskop och western blot, vilket är nödvändigt för screening i syfte att bekräfta den rätta i vivo Översättning av antigen som mål. Emellertid lägre plasmid doser (0,5 – 1 µg) kan vara användbar för andra typer av experimentell användning.

Avslutningsvis kan detta protokoll för immunisering av vuxen zebrafiskar med en DNA-plasmiden användas för preklinisk testning av nya vaccinkandidater mot olika bakteriella eller virala infektioner. Uttrycket av vaccin antigen som ett GFP-fusionsprotein tillåter visualisering av en framgångsrik immunisering händelse och antigen uttryck. Vi tillämpar denna metod för prekliniska screening av romanen vaccinkandidater antigen mot tuberkulos. För detta, vi infektera den zebrafiskar fem veckor efter vaccination och bestämma bakteriella räknas i varje fisk med qPCR^20,24.

Materials

pCMV-GFP plasmid	Addgene	#11153
2-propanol	Sigma-Aldrich	278475-2L	DNA extraction
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166-5G
Chloroform	Merck	1.02445.2500	DNA extraction
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
FastPrep-24 5G	MP Biomedicals	116005500	homogenizer
Flaming/brown micropipette puller	Sutter Instrument Co.	P-97	Pulling of needles
GeneJet PCR Purification kit	ThermoFischer Scientific	K0701
GFP ELISA kit	Cell Biolabs, Inc.	AKR-121
Guanidine thiocyanate (FW 118.2)	Sigma-Aldrich	G9277-500G	DNA extraction
ImageJ2	imagej.net/Downloads		freely available software
LB Agar	Sigma	L2897-1kg
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522-1kg
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Nikon	AZ100	fluorescense microscope
Microscope	Olympus	ZS61
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head	Electron Microscopy Sciences	SFA-RB
PBS tablets	VWR Chemicals	E404-200TABL.
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
PV830 Phneumatic Pico Pump	WPI	SYS-PV830
QIAGEN Plasmid Maxi kit	Qiagen	ID:12163	plasmid extraction
Sodium citrate (FW294.1)	VWR Chemicals	27833.294	DNA extraction
Tri Reagent	Molecular Research Center, Inc.	TR 118	DNA extraction
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tris (free base) (FW121.14)	VWR Life Science	0497-500G	DNA extraction
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
2.8 mmCeramic beads	Omni International	19-646-3	DNA extraction
2ml Tough tubes with caps	Omni International	19-649	DNA extraction
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Microloader 20 µl	eppendorf	5242956.003	loading tips
Petri dishes, 16 mm	Sarsted	82.1473
Scalpels	Swan Morton	0501
Parafilm	Bemis		laboratory film
Pins
Plastic spoon
Spatula
Sponge
Styrofoam workbench
Tweezers