Her, beskriver vi en metode til i vivo mikrodalyse til at analysere aspartat og glutamat udgivelse i den ventrale hippocampus epileptiske og ikke-epileptiske rotter i kombination med EEG optagelser. Ekstracellulære koncentrationer af aspartat og glutamat kan være korreleret med de forskellige faser af sygdommen.
Mikrodalyse er en veletableret neurovidenskab teknik, der korrelerer ændringer af neurologisk lægemiddelstoffer spreder ind i hjernen interstitielle rum med adfærd og/eller specifikke resultatet af en patologi (fx anfald for epilepsi). Når man studerer epilepsi, er den mikrodalyse teknik ofte kombineret med kortsigtede eller endda langsigtede video-electroencefalografi (EEG) overvågning for at vurdere spontane anfald hyppigheden, sværhedsgrad, progression og klyngedannelse. Den kombinerede mikrodalyse-EEG er baseret på brug af flere metoder og instrumenter. Her, udførte vi i vivo mikrodalyse og kontinuerlig video-EEG optagelse til skærm glutamat og aspartat udstrømning over tid, i forskellige faser af den naturlige historie af epilepsi i en rotte model. Dette kombinerede tiltag giver mulighed for parring af ændringer i neurotransmitter frigivelse med bestemte faser af udvikling af sygdom og progression. Koncentrationen af aminosyren i den dialysat var bestemt af væskekromatografi. Her, vi beskrive metoder og skitsere de vigtigste forebyggende foranstaltninger man skal tage under i vivo mikrodalyse-EEG, med særlig vægt på de stereotaxisk kirurgi, basal og høj kalium stimulering under mikrodalyse, dybde elektrode EEG registrering og højtydende væskekromatografi analyse af aspartat og glutamat i den dialysat. Denne tilgang kan tilpasses til at teste forskellige stof eller sygdom induceret ændringer af de fysiologiske koncentrationer af aspartat og glutamat i hjernen. Afhængigt af tilgængeligheden af en passende analytisk assay, kan det yderligere bruges til at teste forskellige opløselige molekyler, når ansætte EEG optagelse på samme tid.
For at give indsigt i den funktionelle svækkelse af glutamat-medieret excitatoriske og GABAergic hæmmende neurotransmission resulterer i spontane anfald i FLE (TLE) har overvåges vi systematisk ekstracellulære koncentrationer af GABA1 og senere niveauer af glutamat og aspartat2 af mikrodalyse i den ventrale hippocampus af rotter på forskellige tidspunkter af sygdommens naturlige kursus, dvs, i løbet af udvikling og progression af epilepsi. Vi tog fordel af TLE pilocarpin model i rotter, som efterligner sygdom meget præcist med hensyn til adfærdsmæssige, elektrofysiologiske og histopatologiske forandringer3,4 og vi korreleret dialysat koncentrationen af amino syrer til sine forskellige faser: den akutte fase efter den epileptogenic fornærmelse, latency fase, tidspunktet for den første spontane anfald og kronisk phass5,6,7. Indramning sygdom faser blev aktiveret af video-EEG langtidsovervågning og præcise EEG og klinisk karakterisering af spontane anfald. Anvendelsen af mikrodalyse teknik forbundet med langsigtede video-EEG overvågning tilladt os at foreslå mekanistiske hypoteser for TLE neuropatologiske. I Resumé tillader teknikken beskrevet i dette håndskrift bindingen af neurokemiske forandringer inden for et defineret hjernen område med udvikling og progression af epilepsi i en dyremodel.
Forbundne enheder, der består af en dybde elektrode sammenstillet til en mikrodalyse kanyle, er ofte beskæftiget i epilepsi forskningsundersøgelser hvor ændringer i neurotransmittere, deres metabolitter eller energi substrater bør være korreleret til neuronal aktivitet. I langt de fleste tilfælde, det bruges i frit opfører dyr, men det også kan gennemføres på samme måde i mennesker, fxi farmako-resistente epileptiske patienter i dybde elektrode undersøgelse før kirurgi8. Både EEG registrering og dialysat samling kan udføres særskilt (f.eks.implantering elektrode i en halvkugle og mikrodalyse sonde i anden halvkugle eller selv udføre mikrodalyse i én gruppe af dyr, mens de udfører den eneste EEG i en anden gruppe af dyr). Dog kobling elektroder til sonder kan have flere fordele: det forenkler stereotaxisk kirurgi, begrænser vævsskader til kun én halvkugle (mens den anden intakt, som et kontrolelement for histologiske undersøgelser), og homogenizes resultater som disse er fremstillet af det samme område af hjernen og de samme dyr.
På den anden side kræver forberedelse af koblede mikrodalyse sonde-elektrode enhed færdigheder og tid, hvis det er hjemmelavet. Man kunne bruge relativt store mængder af penge, hvis købt fra markedet. Desuden, hvornår mikrodalyse sonder (sonde tips er typisk 200-400 µm i diameter og 7-12 mm lange)9og EEG elektroder (elektrode tips er normalt af 300-500 µm i diameter, og lang nok til at nå den hjerne struktur af interesse10) kombineret, repræsenterer de monterede enhed en pladskrævende og relativt tunge objekt på den ene side af hovedet, som er besværlige for dyr og tilbøjelige til at være tabt, især når det er tilsluttet til dialyse pumpen og hårdt-wire EEG optagelse system. Dette aspekt er mere relevante i epileptiske dyr, der er svære at håndtere og mindre adaptive til mikrodalyse sessioner. Korrekte kirurgiske teknikker og passende postoperativ pleje kan resultere i langvarig implantater, der forårsager minimal animalske ubehag og bør videreføres for combinatory mikrodalyse-EEG eksperimenter10,11, 12.
Fordele og begrænsninger af den mikrodalyse teknik er blevet behandlet i detaljer af mange neuroforskere. Dens primære fordel over andre i vivo perfusion teknikker (f.eks., hurtigt flow push-pull eller kortikale cup perfusion) er en lille diameter af sonden, der dækker et relativt præcise område af interesse13,14, 15. For det andet skaber den mikrodalyse membran en fysisk barriere mellem væv og perfusate; derfor høj Molekylær vægt stoffer krydse ikke og forstyrrer ikke analysen16,17. Desuden, væv er beskyttet fra turbulent strømning af perfusate18. En anden vigtig fordel er muligheden for at ændre perfusate strømmen for at maksimere analysandens koncentration i perfusate (dvs., processen med mikrodalyse godt kan defineres matematisk og kan ændres til at give høj koncentrationer af analysand i prøveopløsningen)19. Endelig, teknikken kan bruges til at indgyde stoffer eller restkoncentrationer af farmakologisk virksomme stoffer i væv af interesse og bestemme deres virkning i stedet for intervention20. På den anden side har mikrodalyse en begrænset løsningstid (typisk mere end 1 min på grund af den nødvendige tid til indsamling af prøver) i forhold til elektrokemisk eller biologiske sensorer; Det er en invasiv teknik, der forårsager vævsskader; Det bringer den neurokemiske balance i rummet omkring membran på grund af den fortsatte koncentration graduering af alle opløselige stoffer, der træder perfusate sammen med analysanden af interesse. Endelig, den mikrodalyse teknik er stærkt påvirket af grænserne for de analytiske teknikker anvendes til kvantificering af stoffer i perfusate9,21,22,23 . High-performance væskekromatografi (HPLC) efter forædling med orthophthaldialdehyde for glutamat og aspartat analyse i biologiske prøver er blevet godt valideret24,25,26 , 27 og dens omfattende diskussion er ikke omfattet af dette manuskript, men de data, der er produceret ved hjælp af denne metode vil blive beskrevet i detaljer.
Når udført korrekt og uden ændringer af perfusate sammensætning, kan mikrodalyse give pålidelige oplysninger om de basale niveauer af neurotransmitter frigivelse. Den største del af de basale niveauer er sandsynligvis et resultat af senderen afsmitning fra synapser9. Fordi i mange tilfælde enkel prøveudtagning af neurotransmitter i det ekstra synaptic rum ikke er tilstrækkelige til at forfølge målene i en undersøgelse, kan mikrodalyse teknik anvendes også, at stimulere neuroner eller at fratage dem vigtige fysiologiske ioner som K+ eller Ca2 +, at fremmane eller forhindre frigivelse af neurotransmitter.
Høj K+ stimulation er ofte brugt i neurobiologi for at stimulere neuronal aktivitet ikke blot i vågen dyr, men også i grundskolen og organotypic kulturer. Udsættelse af en sund centralnervesystemet til løsninger med høje koncentrationer af K+ (40-100 mM) fremkalder udstrømningen af neurotransmittere28. Denne evne af neuroner til at give en yderligere frigivelse i svar til høj K+ kan blive kompromitteret i epileptiske dyr1 og andre neurodegenerative sygdomme29,30. Ligeledes frigive Ca2 + afsavn (fremstillet ved perfusing Ca2 + gratis løsninger) bruges til at etablere calcium-afhængige af de fleste neurotransmittere målt ved mikrodalyse. Det menes generelt, Ca2 + afhængige frigivelse er af neuronal oprindelse, hvorimod Ca2 + selvstændig frigivelsen stammer fra glia, men mange undersøgelser rejst kontrovers over betydningen af Ca2 +-følsomme målinger af f.eks. glutamat eller GABA9: således, hvis det er muligt, er det tilrådeligt at støtte mikrodalyse undersøgelser med mikrosensorer undersøgelser, som sidstnævnte har højere spatial opløsning og elektroderne giver mulighed for at komme tættere på synapser31.
Vedrørende mikrodalyse undersøgelser i epileptiske dyr er det vigtigt at understrege, at oplysninger indhentet fra de fleste af dem afhængige af video eller video-EEG overvågning af anfald, dvs, forbigående forekomsten af tegn og/eller symptomer på grund af unormale overdreven eller synkron neuronal aktivitet i hjernen32. Der er noget specielt for electrographic anfald i pilocarpin behandlet dyr, som bør overvejes, når du forbereder eksperimentet. Spontane anfald efterfølges af deprimeret aktivitet med hyppige EEG interictal pigge3 og forekomme i klynger33,34. Forlorne drives ikke-epileptiske dyr kan udstille beslaglæggelse-lignende aktivitet35 og derfor parametre for EEG optagelser evaluering bør være standardiseret36 og, hvis det er muligt, timingen af mikrodalyse sessioner skal være veldefineret. Endelig, vi varmt anbefale følgende principper og metodologiske standarder for video-EEG overvågning i kontrol voksen gnavere skitseret af eksperter fra internationale liga mod epilepsi og amerikanske epilepsi samfund i deres meget nylige rapporterne37 ,38.
Her beskriver vi mikrodalyse af glutamat og aspartat parallelt med de langsigtede video-EEG optagelser i epileptiske dyr og deres analyse i den dialysat ved HPLC. Vi vil understrege de kritiske trin i den protokol, som man bør tage sig af for bedste resultat.
I dette arbejde viser vi, hvordan en kontinuerlig video-EEG registrering kombineret med mikrodalyse kan udføres i en eksperimentel model af FLE. Video-EEG optagelse teknikker bruges til at korrekt diagnosticere de forskellige faser af sygdomsprogression i dyr og mikrodalyse teknik bruges til at beskrive de ændringer i glutamat udgivelse, der forekommer i tid (ingen ændringer er blevet fundet for aspartat i en tidligere offentliggjort undersøgelse2). Vi anbefaler brugen af en enkelt enhed/impla…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Anna Binaschi, Paolo Roncon og Eleonora Palma for deres bidrag til manuskripter udgivet i forrang.
3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
Altadol 50 mg/ ml – tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
Valium 10 mg/2 ml – diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |