Un método In Vivo para evaluar la barrera intestinal-sangre y hígado metabolismo de la Microbiota de productos
Summary
El acceso de nutrientes, metabolitos de la microbiota y medicamentos para la circulación es controlado por la barrera intestinal-sangre (GBB). Se describe un método directo para medir la GBB permeabilidad en vivo, que, en contraste con métodos indirectos utilizados, prácticamente no es afectado por las funciones de hígado y riñón.
Abstract
La barrera intestinal-sangre (GBB) controla el paso de nutrientes, metabolitos bacterianos y medicamentos desde la luz intestinal al torrente sanguíneo. La integridad GBB se altera en enfermedades gastrointestinales, cardiovasculares y metabólicas, que pueden resultar de más fácil acceso de compuestos biológicamente activos, tales como metabolitos bacterianos de tripa, al torrente sanguíneo. Así, la permeabilidad de la GBB puede ser un marcador de enfermedades intestinales y extraintestinales. Además, la creciente penetración de metabolitos bacterianos puede afectar el funcionamiento de todo el organismo.
Métodos comúnmente utilizados para el estudio de la permeabilidad GBB son realizados ex vivo. La exactitud de estos métodos es limitada, ya que el funcionamiento de la GBB depende del flujo sanguíneo intestinal. Por otra parte, métodos utilizados en vivo pueden estar sesgados por el hígado y el funcionamiento del riñón, como los métodos que se basan en la evaluación de la orina o / y periféricos de la sangre las concentraciones de marcadores exógenos. Aquí, presentamos una medida directa de la permeabilidad de la GBB en ratas utilizando un método en vivo basado en muestreo, de la sangre portal que preserva el flujo sanguíneo intestinal y prácticamente no es afectada por la función de hígado y riñón.
Catéteres de poliuretano se insertan en la vena porta y vena cava inferior justo por encima de la hepático venas confluencia. Sangre se muestrea al inicio y después de la administración de un marcador seleccionado en una parte deseada del tracto gastrointestinal. Aquí, presentamos varias aplicaciones del método incluyendo (1) evaluación de la permeabilidad del colon a TMA, un metabolito bacteriano intestinal (2) evaluación de la depuración hepática de TMA y (3) evaluación de un camino de sangre de sangre-hígado-periférico de gut-portal de tripa ácidos de grasos de cadena corta derivados de bacterias. Además, el protocolo puede utilizarse también para el seguimiento de la absorción intestinal y metabolismo hepático de drogas o para las mediciones de la presión portal.
Introduction
La barrera intestinal-sangre (GBB), también conocida como la barrera intestinal, es un sistema complejo de múltiples capas que separa el lumen del intestino al torrente sanguíneo con el fin de limitar el paso de los dañinos compuestos permitiendo la absorción de nutrientes1. Consta de tres capas principales: la capa de moco, epitelio y lámina propia.
Numerosos factores pueden afectar la integridad y función GBB2. Se ha demostrado que GBB se disturba en enfermedades gastrointestinales y extraintestinales, incluyendo enfermedades cardiovasculares y metabólicas3, que puede conducir a un mayor pasaje de metabolitos bacteriano del intestino al torrente sanguíneo4. Una mayor penetración de metabolitos bacterianos intestinales puede afectar el funcionamiento de todo el organismo. Por ejemplo, estudios recientes han demostrado un impacto significativo de metabolitos bacterianos, como indoles, H2S, ácidos grasos de cadena corta (SCFA) y trimetilamina n-óxido, el sistema circulatorio funciones5,6,7 ,8,9. Por último, se ha propuesto que un aumento de la permeabilidad GBB puede servir como un marcador de enfermedades cardiovasculares y metabólicos que se asocian a alteraciones morfológicas y funcionales en el intestino10. Por lo tanto, la vía de la sangre arterial sistémica para el hígado intestino-portal de metabolitos bacterianos de seguimiento puede ser de interés para las ciencias básicas y clínicas.
Comúnmente utilizados métodos experimentales para la evaluación de la permeabilidad de la GBB están realizados en vitro con segmentos de intestino resecados, fragmentos de mucosa, o de las membranas artificiales11,12. La exactitud de estos métodos se ve comprometida por el hecho de que el buen funcionamiento de la GBB requiere flujo sanguíneo intestinal constante. Por otro lado, los métodos disponibles en vivo se basan en la evaluación de la orina o sangre periférica concentraciones de marcadores exógenos13. Sin embargo, la concentración periférica de sangre y orina de compuestos exógenos está influenciada por la función renal, es decir, la tasa de filtración glomerular y excreción tubular, así como por el metabolismo hepático, es decir, primero pase el metabolismo. Ambos parámetros pueden variar significativamente entre sujetos de estudio independientemente de la función GBB.
Este papel describe una medida directa de la permeabilidad de la GBB en ratas utilizando muestras de sangre portal. Este método en vivo preserva el flujo sanguíneo intestinal y prácticamente no está influenciado por la función de hígado y riñón. El enfoque descrito no suele utilizarse, posiblemente debido a algunas dificultades metodológicas. Describimos en detalle la cateterización de la vena porta y vena cava inferior justo por encima de la confluencia de la vena hepática. La muestra de sangre de la vena porta y vena cava inferior permite la evaluación de la separación de la permeabilidad y el hígado GBB, así como seguimiento del camino de la sangre arterial sistémica para el hígado intestino-portal de moléculas de interés, como metabolitos bacterianos intestinales o medicamentos. También presentamos varias aplicaciones del método que fueron probados en nuestro laboratorio. Estos incluyen la evaluación de la permeabilidad del colon a TMA, un metabolito bacteriano intestinal, evaluación de la depuración hepática de TMA y evaluación de un camino de sangre sangre hígado sistémica gut-portal de SCFA.
Para evaluar permeabilidad de la barrera intestinal-sangre, deben seguirse los siguientes pasos del Protocolo, en orden: 1 (inserción de la línea para las administraciones intraintestinal), 3 (cateterización de la vena porta), 4 (muestreo de la sangre de la vena porta ), 6 (administración de un marcador de permeabilidad intestinal), 4.
Para evaluar la separación hepática y un camino de sangre sangre hígado sistémica gut-portal, deben seguirse los siguientes pasos del Protocolo, en orden: 1 (inserción de la línea para las administraciones intraintestinal), 2 (vena cava inferior cateterismo), 3 (cateterización de la vena porta), 4 (muestra de sangre de la vena porta), 5 (muestra de sangre de la vena cava inferior), 6 (administración de un marcador de permeabilidad intestinal), 4, 5, () 7 cálculo de aclaramiento hepático).
Protocol
Representative Results
Discussion
El descrito directo, en vivo, método de medición de la permeabilidad GBB mantiene condiciones de closetophysiological en el sistema gastrointestinal (conserva el flujo de sangre intestinal) y prácticamente no está influenciado por la función de hígado y riñón.
El paso crítico de esta técnica es la inserción del catéter portal. Esto debe hacerse con suavidad y contundencia a la vez. Un sangrado leve y corto puede ocurrir de la punción la ejecución correcta de la vena port…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo es apoyado por el Ministerio de ciencia y enseñanza superior de Polonia, diamante subsidio no: DI2017 009247.
Materials
| Needle OD: 9 mm | Becton Dickinson S.A. | 301300 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-40 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-25 | |
| C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD | Cole-Parmer Instrument Co. | 06424-59 | |
| Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F) | Sigmed | 0000 80305 | |
| Surgical ligatures 3/0 | Yavo Sp. Z o.o. | P48JE | |
| Absorbable surgical sutures – Polyglactine 910 4/0 | KRUUSE Polska Sp. Zo.o. | 152336 | |
| Tissue glue – Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive | Loctite | 1370127 | |
| Povidone iodine | EGIS Pharmaceuticals PLC | 4449 11 | |
| Heparin – Heparinium WZF | WZF Polfa S.A. | 02BK0417 | Dilute 10 times with physiological saline |
| Glycerin 86% | Laboratorium Farmaceutyczne Avena | 5.90999E+12 | Serves as a lubricant in colon catheterization |
| Xylocaine 2% | AstraZenca | 9941342 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich (Merck) | U2500-500G | |
| Trimethylamine solution 45% | Sigma-Aldrich (Merck) | 92262-1L | |
| Syringes 2 mL | B.Braun Melsungen AG | 4606027V | |
| Saline 250 mL | Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o. | 15LL707WL | |
| Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends | Braun | NS-010-115-PKM | |
| Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 " | Braun | KN-008-140-ZMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7×0.55 | Braun | PO-001-007-ZMK | |
| Micro Scissors type Vannas, straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm | Braun | NO-010-085-PMK | |
| Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8" | Braun | HO-128-130-PMK | |
| Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2 | Braun | IM-927-150-PZMK | |
| Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp | Braun | NO-052-110-PMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp | Braun | PO-022-001-PMK | |
Riferimenti
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