Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação
Summary
Descrevemos a montagem, operação, e limpeza de um aparelho de fluxo projetado para formação de biofilmes fúngicas de imagem em tempo real enquanto sob fluxo. Também fornecemos e discutir algoritmos quantitativos para ser usado nas imagens adquiridas.
Abstract
Na candidíase orofaríngea, membros do gênero Candida devem aderir e crescer na superfície da mucosa oral, enquanto sob os efeitos do fluxo salivar. Enquanto foram desenvolvidos modelos para o crescimento sob fluxo, muitos destes sistemas são caros, ou não permita que enquanto as células estão sob fluxo de imagem. Nós desenvolvemos uma novela aparelho que permite o crescimento e desenvolvimento das células de Candida albicans em fluxo e em tempo real da imagem. Aqui, detalhamos o protocolo para a montagem e a utilização deste aparelho de fluxo, bem como a quantificação dos dados que são gerados. Somos capazes de quantificar as taxas que as células anexar e desanexar do slide, bem como a determinar uma medida da biomassa no slide ao longo do tempo. Este sistema é econômico e versátil, trabalhando com vários tipos de microscópios de luz, incluindo microscópios de bancada barata, e é capaz de estendido vezes comparados a outros sistemas de fluxo de imagem. Globalmente, este é um sistema de baixa taxa de transferência que pode fornecer informações em tempo real altamente detalhadas sobre o crescimento de biofilmes de espécies de fungos sob fluxo.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) é um patógeno oportunista fúngico dos seres humanos que podem infectar vários tipos de tecido, incluindo as superfícies da mucosa orais, causando candidíase orofaríngea e resultando em uma baixa qualidade de vida para os indivíduos afetados1. Formação de biofilme é uma característica importante para a patogênese da c. albicans, e numerosos estudos foram feitos sobre a formação e a função de c. albicans biofilms2,3,4, 5, muitas das quais têm sido realizadas usando estática (sem fluxo) em vitro modelos. No entanto, c. albicans deve aderir e crescer na presença de fluxo salivar na cavidade oral. Numerosos sistemas de fluxo foram desenvolvidos para permitir viver-pilha de imagem6,7,8,9,10. Estes sistemas de fluxo diferentes foram projetados para diferentes fins, e, portanto, cada sistema possui diferentes pontos fortes e pontos fracos. Nós achamos que muitos do fluxo de sistemas adequados para c. albicans foram caros, complexo exigido fabricado peças, ou não poderia ser fotografado durante o fluxo e teve que ser interrompido antes da imagem latente. Portanto, desenvolvemos um aparelho novo fluxo para estudar a formação de biofilmes de c. albicans sob fluxo11. Durante o design do nosso aparelho de fluxo, seguimos estas considerações principais. Primeiro, queríamos ser capaz de quantificar os múltiplos aspectos do crescimento do biofilme e desenvolvimento em tempo real, sem exigir o uso de células fluorescentes (permitindo-nos para estudo de cepas mutantes e isolados clínicos não modificados facilmente). Em segundo lugar, queríamos que todas as partes para ser comercialmente disponíveis com pouca ou nenhuma modificação (i. e., sem fabricação personalizada), permitindo que outros para mais facilmente recriar nosso sistema e permitindo a fácil reparação. Em terceiro lugar, queríamos também permitem extensa imagem vezes em taxas de fluxo razoavelmente alta. Por fim, queríamos, após um período de células anexar ao substrato sob fluxo, poder acompanhar o crescimento do biofilme durante um tempo prolongado sem a introdução de novas células.
Estas considerações nos levaram a desenvolver o sistema de recirculação fluxo dois-balão ilustrado na Figura 1. Os dois balões nos permitem dividir a experiência em duas fases, uma fase de fixação que retira o recipiente acessório celular-semeado e uma fase de crescimento que usa mídia sem célula para continuar o crescimento do biofilme sem a adição de novas células. Este sistema é projetado para trabalhar com uma câmara de incubação para o microscópio, com o slide e o tubo de precedê-lo (2 a 5, Figura 1), sendo colocado dentro da incubadora, e todos os outros componentes colocados em um grande recipiente secundário fora do microscópio. Além disso, um agitador de placa de aquecimento com uma sonda de temperatura anexado é usado para manter as células fúngicas no recipiente de apego a 37 ° C. Como ele é de recirculação, este sistema é capaz de imagem contínua durante o fluxo (pode ser mais de 36 h, dependendo de condições) e pode ser usado em microscópios mais padrão, incluindo microscópios de bancada vertical ou invertida. Aqui, vamos discutir a montagem, operação, e limpeza do aparato de fluxo, bem como fornecer alguns algoritmos de ImageJ base quantitativos para analisar os vídeos depois de uma experiência.
Protocol
Representative Results
Discussion
Conforme descrito acima usar o sistema de fluxo permite a geração de quantitativos vídeos Time-Lapse de biofilme fungal crescimento e desenvolvimento. Para permitir comparações entre experiências é de fundamental importância para garantir que os parâmetros de imagem são mantidos os mesmos. Isto inclui assegurar que o microscópio é configurado para iluminação de Köhler para cada experimento (muitos guias estão disponíveis on-line para este processo). Além de parâmetros de imagem, existem alguns passos i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Wade Sigurdson para fornecer valioso contributo na concepção do aparato de fluxo.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
Riferimenti
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
