Identificazione di eventi di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali del Mouse mediante Southern Blotting e reazione a catena della polimerasi
Summary
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per identificare gli eventi di ricombinazione omologa che si è verificato nelle cellule staminali embrionali del mouse usando macchiare del sud e/o PCR. Questo metodo è esemplificato dalla generazione di modelli di non muscolare miosina II sostituzione genetica del mouse utilizzando tradizionale embrionale basati su cellule staminali omologa ricombinazione mediata tecnologia di targeting.
Abstract
Relativo alle edizioni degli effetti fuori bersaglio e la difficoltà di inserimento di un frammento di DNA lungo nell’applicazione del progettista nucleasi per staminali embrionali, modifica del genoma (ES) basati su cellule gene-targeting tecnologia non ha queste carenze ed è ampiamente utilizzato per modificare il genoma di animali/mouse che vanno da grandi delezioni/inserzioni a sostituzioni di singoli nucleotidi. In particolare, identificazione degli eventi di ricombinazione omologa (HR) relativamente pochi necessari ottenere desiderato ES cloni è un passo fondamentale, che richiede metodi accurati e affidabili. Macchiarsi del sud e/o PCR convenzionale sono spesso utilizzati per questo scopo. Qui, descriviamo le modalità di utilizzo di questi due metodi per identificare gli eventi HR che si sono verificati in cellule di topo ES in cui il gene Myh9 endogeno è destinato ad essere interrotto e sostituito da cDNA codificanti altre catena pesante di miosina non muscolare IIs (IIs NMHC). Tutta la procedura di macchiare del sud comprende la costruzione di targeting tutt’, elettroporazione, selezione della droga, l’espansione e la conservazione di cellule ES/cloni, la preparazione, la digestione e macchiare del DNA genomico (gDNA), l’ibridazione e lavaggio della/delle sonde e una fase finale di autoradiografia sulle pellicole di raggi x. PCR può essere eseguita direttamente con gDNA preparato e diluito. Per ottenere risultati ideali, le sonde e l’enzima di restrizione (ri) siti di taglio per macchiare del sud e i primers per la PCR deve essere pianificati con attenzione. Anche se l’esecuzione di macchiare del sud è molto tempo e laborioso e risultati di PCR sono falsi positivi, la corretta identificazione di Southern blotting e screening rapido mediante PCR consentono l’applicazione di sola o in combinazione di questi metodi descritti in questa carta per essere ampiamente utilizzati e consultati dalla maggior parte dei laboratori nell’identificazione di genotipi di cellule ES e geneticamente animali modificati.
Introduction
La tecnologia del gene targeting per HR in cellule ES murine fornisce un potente strumento per la dissezione delle conseguenze cellulari di specifiche mutazioni genetiche1,2. L’importanza e il significato di questa tecnologia sono riflessi nel suo riconoscimento dal 2007 Premio Nobel in fisiologia o medicina3,4; nel frattempo, rappresenta l’avvento dell’era moderna di ingegneria gene5. Gene targeting attraverso HR può essere utilizzato per progettare virtualmente qualsiasi alterazione che vanno da mutazioni puntiformi a grandi riorganizzazioni cromosomiche nel genoma del topo le cellule ES6,7. È noto che, prima della nascita di strumenti di editing del cosiddetto genoma, la generazione di un mouse di knockout del gene necessaria l’applicazione di tecnologia di targeting di gene in cellule ES8,9,10. Durante le due decadi scorse, più di 5.000 topi gene targeting sono state prodotte da questo approccio per malattie umane di modellazione o studiare funzioni gene11. Uno sforzo di genoma ad eliminazione diretta è stato stabilito per la distribuzione dei vettori gene-targeting, cloni di cellule ES mirati e topi dal vivo per la comunità scientifica2,12,13,14 , 15. indubbiamente, tecnologia da gene-targeting HR-mediata basati su cellule ES ha notevolmente migliorato la nostra comprensione delle funzioni dei geni giocati nel contesto fisiologico o patologico.
Perché HR è un evento relativamente raro nei mammiferi le cellule16,17, l’importante e il prossimo passo seguendo gene-targeting in cellule ES murine è quello di analizzare numerose colonie di ES per l’identificazione di alcuni cloni con mutazioni derivanti da HR con il targeting per vector18. I metodi d’oro per identificare gli eventi HR includono Southern blotting e PCR19,20. I vantaggi degli approcci comprendono che macchiarsi del sud può identificare correttamente mirati ES cloni e permette ai ricercatori di analizzare la struttura dell’evento gene targeting, come una verifica di un inserimento di copia singola del costrutto, mentre un Strategia basata su PCR permette più rapido di screening per HR eventi21,22. Anche se questi metodi sono inconvenienti, quali che essi sono che richiede tempo e possono avere falsi positivi, il loro utilizzo combinatorio è ampiamente accettati e applicati dalla maggior parte dei laboratori nell’identificare eventi HR, particolare in cellule ES, per generare geneticamente modificata animali.
Tre isoforme della miosina non muscolare II (NM II) nei mammiferi, ciascuno composto da due identici NMHC IIs che sono codificati da tre geni differenti (denominati Myh9, Myh10 e Myh14) e due coppie di catene leggere, sono denominate NM II A, II B e II-C23. Gli studi precedenti hanno indicato che almeno le isoforme di NM II A e II B sono essenziali per lo sviluppo del mouse perché l’ablazione in vivo di queste isoforme provoca mortalità embrionale24,25,26. Per aggirare questo problema e ottenere nuove conoscenze sulle funzioni specifiche di isoforma di NM II A e II B nelle fasi successive di sviluppo del topo, una sostituzione di genetica è stata adottata la strategia utilizzando tecnologia di gene-targeting HR-mediata basati su cellule ES a generare una serie di modelli di mouse27. Nel corso di identificare i cloni ES desiderati, Southern blotting e metodi di PCR sono stati utilizzati, e questi si è rivelata efficiente e affidabile27,28.
Questo libro intende fornire una descrizione dettagliata di Southern blotting e PCR, compresa la progettazione di targeting tutt’, le sonde e gli iniettori e l’esecuzione di esperimenti, così come l’analisi dei risultati esemplificato identificando evento HR avvenimento in cellule ES per la creazione del mouse sostituzione genetica NM II modelli e dati rappresentativi. I protocolli di questi due metodi qui presentati possono essere adottati anche per l’identificazione dei genotipi di cellule geneticamente modificate o di animali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Attualmente, progettista nucleasi per editing genomico ancora non possono sostituire la tecnologia di gene-targeting basati su cellule ES a causa di suoi problemi di effetti fuori bersaglio e la difficoltà nell’inserimento di un lungo di30,di DNA frammento31. Come i metodi d’oro per identificare gli eventi HR che si sono verificati in cellule di topo ES, questo rapporto fornisce un protocollo dettagliato di Southern blotting e PCR per il campo. Abbiamo validato …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro ha ricevuto il supporto dal programma generale del National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni No. 31571432), l’umano provinciale Natural Science Foundation della Cina (Grant No. 2015JC3097) e la Fondazione ricerca di formazione Bureau di Hunan Provincia, Cina (Grant n ° 15 K 054).
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
Riferimenti
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