Separação de espinafre tilacoides complexos de proteínas por eletroforese em Gel verde nativo e caracterização de banda usando contagem de fóton único Time-Correlated

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para complexos de tilacoides solubilizado, separadas por eletroforese em Gel de verde nativo. Bandas de gel verde posteriormente são caracterizadas por tempo correlacionados Single Photon contagem (TCSPC) e etapas básicas para análise de dados são fornecidas.

Abstract

As reações de luz da fotossíntese são realizadas por uma série de complexos de proteínas pigmentadas nas membranas tilacoides. A estequiometria e organização destes complexos é altamente dinâmico no longo e escalas de tempo curto devido a processos que se adaptam a fotossíntese para mudanças nas condições ambientais (ou seja, não-fotoquímica têmpera, transições de estado e o resposta a longo prazo). Historicamente, estes processos têm sido descritos espectroscopicamente em termos de mudanças na fluorescência da clorofila, e espectroscopia continua a ser um método vital para o monitoramento de parâmetros fotossintéticos. Há um número limitado de maneiras em que a subjacente dinâmica complexa de proteínas pode ser visualizada. Aqui nós descrevemos um método rápido e simples para a separação de alta resolução e visualização dos tilacoides complexos, eletroforese em gel verde nativo. Este método é acoplado com tempo-correlacionados fotão contando para caracterização detalhada das propriedades de fluorescência da clorofila das bandas separadas no gel verde.

Introduction

Organismos fotossintéticos constantemente devem ajustar sua fisiologia para mudanças nas condições ambientais para maximizar sua produtividade e competir com sucesso com os vizinhos,¹. Isto é especialmente verdadeiro para a maquinaria responsável para as reações de luz da fotossíntese, como luz ambiente condições podem flutuar por três ordens de magnitude entre as sombras e a luz do sol. Além disso, fatores ambientais como estresse de calor, frio ou seca podem reduzir a disponibilidade de dióxido de carbono para a fixação de carbono, que é o coletor de elétrons naturais para os produtos das reações luz. Plantas devem, portanto, colher e utilizar radiação solar de forma mais eficiente possível, mantendo a capacidade de dissipar a energia da luz em excesso, se necessário. Enquanto photooxidative dano ainda ocorre rotineiramente sob todas as condições de luz^2,3, falha para gerenciar a energia absorvida da excitação com êxito pode levar a célula catastrófico dano e morte. Vários mecanismos adaptativos existem que permitem que o aparato fotossintético a ser afinado para mudanças nas condições ambientais prevalecentes e flutuações transiente (ou seja, em escalas de tempo longas e curtas)⁴. Estes incluem a resposta a longo prazo (LTR) e não-fotoquímica têmpera (NPQ). NPQ é considerado para abranger pelo menos três outros fenômenos de componente, incluindo transições de estado (qT), energia rapidamente inducible têmpera (qE) e Fotoinibição (qI)⁵.

Estes processos foram originalmente observados e definidos em grande parte em termos de fenômenos espectroscópicos [por exemplo, NPQ refere-se a uma gota na fluorescência de clorofila observados (têmpera da fluorescência da clorofila) que não é devido a um aumento da taxa de fotoquímica]⁶. O termo “transições de estado” da mesma forma se refere a mudança observada no montante relativo de fluorescência da PSI e do FSII⁷. Enquanto as técnicas espectroscópicas que tornaram possível a enumeração destes fenómenos [em particular, amplitude de pulso modulada espectroscopia de fluorescência (PAM)] e continuar a ser um meio vital para a observação e dissecando processos fotossintéticos em vivo, uma grande quantidade de bioquímica é necessário para elucidar os mecanismos subjacentes a estas observações espectroscópicas. Transições de estado, por exemplo, envolve um ciclo de fosforilação/desfosforilação de proteínas LHCII pelo STN7 quinase e fosfatase TAP38/PPH1, respectivamente,^8,9,10. Este ciclo ajusta a distribuição física da antena LHCII entre as dois fotossistemas movendo uma porção de trímeros LHCII do FSII para PSI, alterando assim a absorção de secção transversal dos fotossistemas^11,12. O componente qE de NPQ rapidamente converte energia de excesso de excitação em calor através das acções do ciclo de epoxidação/de-epoxidação violaxantina/zeaxantina e a proteína PsbS. O papel exato do PsbS neste processo é que ainda não foi totalmente compreendido¹³. O componente de qI de NPQ, Fotoinibição, é geralmente atribuído a danos à proteína D1 do FSII. Restauração de competência total fotossintética requer um processo de reparação elaborado para corrigir danificados do FSII photocenters. O ciclo de reparação do FSII envolve a migração de complexos do FSII fora as pilhas granal, desmantelamento dos complexos, substituição de proteínas danificadas de D1, remontagem dos complexos do FSII e movimento de complexos do FSII volta para as pilhas granal¹⁴. A natureza exata do Fotoinibição e do FSII Fotodano continua a ser um objecto de intenso escrutínio¹⁵.

A dificuldade em estudar fenómenos como o estado faz a transição ou reparação do FSII surge, em parte, do fato de que há não uma maneira simples de visualizar a mecânica de sistemas bioquímicos complexos. A abordagem clássica de bioquímica para o entendimento de um processo é primeiro separar seus componentes para que eles podem ser caracterizados em isolamento. Eletroforese em gel de nativo surgiu de esforços bem sucedidos na década de 1980 para separar e caracterizar os complexos de fotossistema de membranas tilacoides com mais métodos preparativa (centrifugação gradiente de sacarose e cromatografia)¹⁶. Os detergentes sistemas desenvolvidos para solubilizar suavemente os complexos nativos de membranas tilacoides logo foram adaptados para métodos de separação eletroforética, mais notavelmente por Allen e Staehelin¹⁷ e e Pedro e Thornber¹⁸, dando origem a eletroforese em gel verde nativo. Enquanto representando apenas um fora de uma variedade de técnicas no arsenal experimental, nativo de página tem um número de características atraentes que a tornaram um método muito utilizado em pesquisas de fotossíntese. PÁGINA nativa é relativamente rápido e simples, que requerem equipamento pouco especializado, proporcionando simultaneamente uma separação de alta resolução de um grande número de complexos de tilacoides. Isso faz o nativa página uma ferramenta conveniente para estudar a dinâmica de tilacoides e, quando combinado com página padrão na segunda dimensão, bem como uma variedade de sistemas tampão e detergente, um sistema versátil para localizar e caracterizar novos complexos de tilacoides.

Dito isso, géis verdes nativos teve uma reputação de ser uma técnica não-confiável, especialmente em mãos inexperientes, como é fácil produzir maus resultados consistindo de géis fuzzy, manchadas com poucas bandas. Este problema foi resolvido, em parte, com a introdução do azul-nativo página¹⁹. O uso de tintura de coommassie no sistema de reserva BN faz separação de proteína mais robusto. Portanto, BN-página é frequentemente uma técnica mais fácil e mais confiável para um novato relativo para configurar e pode fornecer separações de alta resolução de complexos de tilacoides. Por estas razões, BN-página tornou-se o método de escolha para a maior parte do trabalho deste campo. Enquanto BN-PAGE é geralmente mais lento funcionar do que a electroforese do gel verde, sua principal desvantagem é que a coloração de tintura coommassie interfere com a identificação das bandas fracas contendo clorofila, respeitando também a jusante espectroscópicas caracterização problemática.

Fornecer as informações bioquímicas géis nativos e SDS-PAGE 2D pode ser grandemente reforçada quando combinados com dados de técnicas espectroscópicas. Independentemente do sistema utilizado, com o uso de géis nativos para identificar complexos, um problema central é que a identificação sempre pode ser contestada (i.e., as proteínas encontradas em uma banda poderia sempre representam comigrating complexos ou componentes, prefiro do que um complexo único fisiologicamente autêntico). Caracterização espectroscópica fornece informações biofísicas sobre os pigmentos nas bandas de gel verde e pode ser usada para determinar quais tipos de complexos são susceptíveis de conter. Fluorescência da clorofila é especialmente útil a este respeito devido ao frequentemente dramàtica diferentes espectros e vidas de fluorescência que são característicos de complexos diferentes pigmentos fotossintéticos-proteína. Enquanto os espectros de fluorescência simples estado estacionário 77K têm sido historicamente útil em confirmar as identidades dos complexos de gel de nativo, moderno tempo-correlacionados fotão contando (TCSPC) pode fornecer muito mais informações. TCSPC permite não só a caracterização dos complexos com base no tempo de vida de fluorescência, mas também torna possível a descrição detalhada de transferência de energia entre os componentes espectrais dentro de um complexo. Este tipo de caracterização está se tornando cada vez mais necessário, como o uso de várias páginas espelhadas de sistemas gel nativo e novos complexos putativos são descobertos, permitindo a identificação de complexos de proteínas para melhor ser autenticado e fornecendo novos biofísicas informações sobre como funcionam estes complexos.

Neste artigo, nós fornecemos um método que permite que aqueles que têm pouca ou nenhuma experiência com eletroforese em gel de nativo para obter uma resolução de alta qualidade de complexos de tilacoides nativa com a finalidade de investigar a mecânica das reações de luz fotossíntese. Esta técnica básica então pode ser aumentada a critério do experimentador para melhorar os resultados ou estender a aplicabilidade de outras espécies. Em seguida descrevemos o processo para submeter gel verde nativo bandas TCSPC, bem como algumas etapas para análise básica e apresentação dos dados fornecidos pela técnica. O acoplamento da electroforese do gel de nativo com análise TCSPC estende a utilidade destes sistemas de gel, fornecendo autenticação e biofísica caracterização de complexos de proteínas dentro das bandas. O sistema do gel verde aqui descrito se baseia que desenvolvido por Allen e Staehelin¹⁷ com algumas modificações e é o mesmo usado em Schwarz et al. ²⁰. este sistema é um dos muitos, mas tem características específicas que são úteis para esta metodologia. É rápida o suficiente para que o isolamento de tilacoides, eletroforese em gel e análise TCSPC conveniente podem ser realizadas em um dia, prevenindo possíveis problemas de degradação e armazenamento de amostra. Encontramos, também, que este método é robusto nas mãos de usuários inexperientes, enquanto continua a fornecer resultados que variam de boa a superior, dependendo do grau de otimização.

É importante ter em mente que os complexos visualizados em um gel nativo dependem sobre o detergente e o buffer de sistemas utilizados, bem como sobre a biologia do organismo sob investigação. Sistemas diferentes de detergente e buffer preferencialmente separam os diferentes tipos de complexos, e um determinado organismo fotossintético terá diferentes complexos de outros organismos, não os quais estarão presentes sob qualquer circunstância. O sistema descrito aqui é particularmente adequado para o estudo da PSI megacomplexes, conforme descrito em Schwarz et al. ²⁰, mas cai na extremidade mais desestabilizador do espectro para quem está estudando megacomplexes do FSII. Para um estudo abrangente dos diversos sistemas de detergente e tampão usada em eletroforese em gel nativa das proteínas de tilacoides, é aconselhável rever Järvi et al. ²¹ e Rantala et al ²².

Protocol

1. as soluções preparação para despejar géis verdes nativas Prepare uma solução tampão concentrado de 4x para a resolução de géis, consistindo de 40% de glicerol, glicina de 200 mM e 100 mM Tris-tamponada de pH 8.3. Prepare uma solução tampão concentrado de 4x para empilhamento géis consistindo de 40% de glicerol, glicina de 200 mM e 100 mM Tris-tamponada de pH 6.3. Armazene esses buffers a 4 ° C para evitar o crescimento de mofo.Nota: Os buffers são estáveis por meses …

Representative Results

Resultados representativos para a electroforese do gel verde são apresentados na Figura 1. Pista 1 fornece um exemplo de resultados ideais para eletroforese em gel verde de espinafre contém, em que um número máximo de faixas verdes claras e nítidas é visível. Estes resultados são um pouco atípicos, em parte porque não todas as bandas que vi na pista 1 estão normalmente presentes em uma determinada amostra. Limpeza da amostra adicional, sob a forma …

Discussion

Um nativo gel executar e solubilização de tilacoides bem sucedida resultará na resolução de várias bandas de verdes visíveis distintas sobre o gel sem distorção significativa ou manchas das bandas. Sobrecarga do gel, uma alta concentração de detergente, um pH de amostra incorreta, não dissolvido material, executando o gel muito rapidamente ou a uma temperatura muito alta, e um gel impropriamente derramado são todos os fatores que podem contribuir para complexos de tilacoides mal resolvido. Otimizar as condi?…

Materials

Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333