Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화
Summary
여기, 우리 세포 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 초파리 비주얼 시스템 내에서 낮은 풍부에 효율적으로 하기 위한 셀 분리 프로토콜을 제시.
Abstract
다음 세대 시퀀싱의 감도에 최근 개선 세포의 작은 숫자 transcriptomic 및 게놈 분석의 적용을 촉진 했습니다. 다양 한 셀 형식 관련 유전자 도구를 자랑 하는 초파리 시각 시스템 개발 연구를이 기술을 활용 하 여 정확한 세포 해상도와 개발의 분자 기초를 해결 하기 위한 강력한 접근 방식을 제공 합니다. 이러한 접근 가능 하, 그것은 안정적이 고 효율적으로 정화 세포는 두뇌 내의 낮은 풍부에서 존재 하는 능력을 중요 하다. 여기, 우리는 유전 모자이크 실험에서 단일 세포 클론의 효율적인 정화를 허용 하는 방법 제시. 이 프로토콜 우리가 지속적으로 달성 셀룰러 고수익 정화 형광을 사용 하 여 정렬 (FACS) (모든 레이블이 지정 된 셀의 25%), 세포를 활성화 하 고 성공적으로 단일 세포 클론 통해 생성에 transcriptomics 분석을 수행 후 repressible 셀 표시 (MARCM)와 함께 모자이크 분석. 이 프로토콜은 transcriptomic 및 게놈 분석에 적용 특정 세포 유형 시각 시스템에서 다른 유전자 조작의 맥락에서 개발의 다른 단계에 걸쳐 이상적 이다.
Introduction
Drosophila 시각 시스템 개발 및 행동의 유전 기초 공부에 대 한 뛰어난 모델입니다. 그것은 특정 세포 유형2,3를 조작 하기 위한 고급 유전자 툴킷 진부한 세포질 건축1 구성 되어 있습니다. 이 시스템의 주요 힘이 자율적으로 유전자 기능 유전 모자이크 방법4,5를 사용 하 여 단일 셀 해상도 셀 형식에는 기능입니다. 우리 셀 형식별 transcriptomic 수행을 다음 세대 시퀀싱에 최근의 진보와 함께 이러한 유전적 도구를 결합 하 고 유전 모자이크 실험에서 복제 하는 단일 셀에 게놈 분석.
이 위해 선택적으로 두뇌에 있는 낮은 풍부한 세포 인구를 분리 하는 강력 하 고 효율적인 방법을 개발 필수적 이다. 이전에 우리는 FACS, 번데기 개발 동안 시각적 시스템에서 특정 세포 유형을 분리 하 고 RNA-seq6을 사용 하 여 그들의 transcriptomes 결정에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 이 실험에서 특정 유형 (예: R7 대뇌)의 세포의 대부분 붙일 표시 했다. 유전 모자이크 실험, 어떤 점에서 동일한 유형의 셀의 하위 집합만 표시 됩니다,이 메서드를 사용 하 여 우리 품질 시퀀싱 데이터를 얻기 위해 충분 한 세포를 분리 하지 못했습니다. 이 해결 하기 위해 우리 셀 분리 프로토콜을 개선 하 여 세포 수확량 증가 하고자 했다.
우리의 접근 방식은 천연된 셀의 건강 극대화, 해 부 및 분리 버퍼를 변경 하 여 세포 건강을 개선 하는 프로토콜의 총 길이 감소 하 고 해 부 조직에 기계적 장애의 양을 줄일 것 이었다. 우리는 repressible 셀 표식5 (MARCM), 단일 붙일 클론 야생 타입 또는 돌연변이의 유전자에 대 한 특정 세포 유형의 분류의 생성 수 있는 모자이크 분석을 사용 하 여 향상 된 프로토콜7 테스트는 그렇지 않으면 heterozygous 비행입니다. 어디, 동일한 조건 하에서 우리의 이전 프로토콜 시퀀스 (seq) RNA에 대 한 충분 한 자료를 생성 하지 못했습니다, 향상 된 프로토콜은 성공적 이었다. 우리 reproducibly 높은 세포 수확량 (레이블이 지정 된 셀의 25%)를 달성 하 고 약간 1000 셀7에서 고품질 RNA-seq 데이터를 가져오는.
여러 프로토콜 이전 초파리6,8,9,10,11,,1213 에 특정 세포 유형을 설명 되었습니다. , 14 , 15 , 16. 이러한 프로토콜은 대부분 뇌 내에서 풍부한 셀을 격리 하기 위한 것. 우리의 프로토콜 FACS를 사용 하 여 후속 transcriptomic 및 게놈 분석에 대 한 시각적 시스템에서 낮은 풍부한 세포 인구 (100 개 미만의 세포 뇌 당)를 분리 하는 데 최적화 되어 있습니다. 우리 reproducibly FACS 및 RNA이 고품질 transcriptome 데이터 취득에 의해 비행 시각 시스템에서 낮은 풍부한 세포를 분리 하는 방법을 제공을 목표로이 프로토콜
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 간단 하 고 실행 하기 기술적으로 곤란 하지 하지만 여러 주요 단계는 것을 간과 하는 경우는 세포의 수율에 상당한 감소를 일으킬. (2.3.2 단계입니다.) 그것은 중요 한 십자가 건강 한, 그리고 음식을 밖으로 건조 하지 않습니다. 십자가의 정규 급수는 바로 유전자 형의 올바른 개발 단계에서 해 부에 사용할 수 있는 파리의 수를 최대화 하려면 필수적입니다. 얼마나 자주 급수 할 필?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NINDS의 보너스 번호 K01NS094545, 신경 퇴행 성 질환의 연구에 대 한 Lefler 센터에서 andgrants에서 건강의 국가 학회에 의해 투자 되었다. 우리 인정 Liming 탄 제이슨 McEwan 귀중 한 대화 합니다.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
Riferimenti
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