ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים
Summary
להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.
Abstract
מאמר זה מציג שיטות ליצירת קרישי פיברין ב חוץ גופית ו ניתוח ההשפעה של חלבון (Aβ) בטא עמילואיד על היווצרות קרישי ומבנה באמצעות ספקטרומטר וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM). Aβ, המהווה אגרגטים עמילואיד העצבים של מחלת אלצהיימר (AD), הוכח לקיים אינטראקציה עם פיברינוגן. אינטראקציה זו Aβ-פיברינוגן הופך קריש פיברין חריגות מבנית ועמיד בפני ופיברינוליזה. Aβ-induced העיוותים פיברין קרישת עשוי גם לתרום היבטים כשאבדן של פתולוגיה לספירה כגון microinfarcts, דלקת, וכן, angiopathy עמילואיד במוח (סי). בהתחשב בתפקיד הגירעונות נוירו-וסקולריים שעשוי להיות קריטי בפתולוגיה לספירה, פיתוח תרכובות אשר יכול לעכב או להפחית את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן יש ערך טיפולי מבטיח. במבחנה שיטות מאת אילו פיברין היווצרות קריש דם יכול בקלות ובאופן שיטתי להידרש הן כלים שימושיים פוטנציאל לפיתוח תרכובות טיפולית. המוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור הדור במבחנה של קריש פיברין, כמו גם ניתוח ההשפעה של מעכבי האינטראקציה Aβ ו- Aβ-פיברינוגן. וזמינותו עכירות קריש דם מהירה, לשחזור מאוד והוא יכול לשמש כדי לבדוק תנאים מרובים בו זמנית, המאפשר הקרנת הסרט מספר גדול של מעכבי Aβ-פיברינוגן. תרכובות פגע ההקרנה הזאת ניתן להעריך עוד יותר בשל יכולתן דהוא Aβ-induced מומים מבניים של האדריכלות קריש פיברין תוך שימוש ב- SEM. היעילות של פרוטוקולים ממוטבת אלה הפגינו כאן באמצעות TDI-2760, מעכב האינטראקציה Aβ-פיברינוגן שזוהו לאחרונה.
Introduction
מחלת אלצהיימר (AD), מחלת ניוון עצבי מוביל לירידה קוגניטיבית בחולים קשישים, יוכפל לאחר המרתו נובע חריג בטא עמילואיד (Aβ), צבירת וביטוי סיווג לקוי וכתוצאה מכך neurotoxicity1, 2. למרות האגודה מאופיין היטב בין Aβ אגרגטים לספירה3, המנגנונים מדויק המחלה פתולוגיה אינם מובנים היטב4. הוכחה גוברת מרמז כי הגירעונות נוירו-וסקולריים לשחק תפקיד התקדמות וחומרת של המודעה5, כפי Aβ ישירות אינטראקציה עם הרכיבים של מערכת הדם6. Aβ יש אינטראקציה גבוהה-זיקה עם פיברינוגן7,8, אשר רגישה גם על פיקדונות Aβ חולי אלצהיימר והן העכבר מודלים9,10,11. יתר על כן, האינטראקציה Aβ-פיברינוגן גורם היווצרות חריגה של clot פיברין, מבנה, כמו גם התנגדות ופיברינוליזה9,12. אפשרות טיפולית אחת בטיפול לספירה, היא שיכוך גירעונות הדם על ידי עיכוב האינטראקציה בין13,Aβ, פיברינוגן14. לכן, זיהינו מספר תרכובות קטן מעכבות את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן באמצעות הקרנה תפוקה גבוהה וכימיה מרפא גישות13,14. כדי לבדוק את היעילות של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן, אנחנו ממוטב שתי שיטות לניתוח של במבחנה היווצרות קרישי פיברין: ייקרש עכירות assay וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)14.
קריש דם עכירות וזמינותו היא שיטה ישר קדימה ומהירה לניטור היווצרות קרישי פיברין באמצעות ספקטרוסקופית UV-גלוי. כמו קריש פיברין טפסים, תאורה מפוזרת יותר ויותר ומגביר עכירות של הפתרון. לעומת זאת, כאשר Aβ קיים, המבנה של קריש פיברין היא שונה, עכירות של התערובת מצטמצם (איור 1). יכול להיות שקובעת את ההשפעה של תרכובות מעכבות היכולת לשחזר עכירות קריש דם Aβ-induced הפרעות. בעוד וזמינותו עכירות מאפשר לניתוח מהיר של תנאים מרובים, הוא מספק מידע מוגבל על צורתו קריש דם. SEM, שבו לטופוגרפיה של חפצים מוצקים מתגלה על ידי אלקטרון הגישוש, מאפשר הניתוח של הארכיטקטורה תלת-ממד של17,18 16,15,קריש דם, את ההערכה של איך הנוכחות של Aβ, תרכובות מעכבות/או משנה את מבנה9,14. הן ספקטרומטר SEM הם וטכניקות מעבדה קלאסית כי שימשו למטרות שונות, לדוגמה, ספקטרופוטומטר משמש לניטור צבירת עמילואיד19,20. באופן דומה, SEM משמש גם כדי לנתח clot פיברין נוצר הפלזמה של אלצהיימר, פרקינסון, שבץ תרומבואמבוליים חולים21,22,23. הפרוטוקולים המובאים כאן הם אופטימיזציה עבור הערכת היווצרות קרישי פיברין בצורה מהירה הדירים.
פרוטוקול הבאים מספק את ההוראות להכנת במבחנה -clot פיברין עם ובלי Aβ. זה גם מפרט את שיטות כדי לנתח את השפעת Aβ על היווצרות קרישי פיברין ומבנה. היעילות של שתי השיטות למדידת עיכוב של האינטראקציה Aβ-פיברינוגן הוכח באמצעות TDI-2760, מתחם מעכבות14קטן. שיטות אלו, הן כיחידים והן יחד, מאפשרים ניתוח מהירה וישירה של במבחנה היווצרות קרישי פיברין.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המתוארות כאן מספקים אמצעי מהיר הדירים הערכת פיברין קריש היווצרות במבחנה. יתר על כן, הפשטות של המערכת הופכת את הפרשנות של מה Aβ משפיע על היווצרות קרישי פיברין ועל מבנה יחסית ישר קדימה. בפרסום הקודם של המעבדה הזאת, זה הוצג כי מבחני אלה יכול לשמש לבדיקת תרכובות על יכולתם לעכב את האי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחברים תודה מסאנורי קוואסקי Kazuyoshi אסו, מייקל פולי מ מכון דיסקברי הרפוי Tri-מוסדית (TDI), ניו-יורק של סינתזה של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן והצעות ערך שלהם. מחברים תודה גם חברי המעבדה סטריקלנד לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי מענק-NIH NS104386 האלצהיימר קרן גילוי סמים, רוברטסון טיפולית הקרן עבור ה, NIH הענק NS50537, מכון דיסקברי הרפוי Tri-מוסדית, אלצהיימר סמים גילוי קרן, קרן משפחת רודין, ג’ון הרמן א עבור אס
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer’s disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer’s disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer’s disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer’s disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer’s disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer’s disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer’s disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson’s disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
