Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析
Summary
フィブリン凝固組織に及ぼす β-アミロイドを分析する個別にまたは組み合わせて使用することができます 2 つの方法は、ここで紹介します。続いて、体外フィブリン血栓を作成する血栓濁度及び走査電子顕微鏡法に含まれている、プロトコルです。
Abstract
この記事は、体外のフィブリン塊の生成と分光法による β アミロイド (a β) 蛋白が血栓形成と構造に及ぼす影響の分析走査電子顕微鏡 (SEM) の方法を紹介します。アルツハイマー病 (AD) における神経毒性アミロイド凝集体を形成、a β は、フィブリノゲンと対話する示されています。この a β フィブリノーゲン相互作用構造的異常および線溶に強いフィブリン血栓になります。A β によるフィブリン凝固異常などけばけば、AD 病理脳血管側面に貢献するかもしれないまた、炎症だけでなく、脳アミロイドアンギオパチー (CAA)。AD 病理脳血管障害の可能性のある重要な役割を与え、有望な治療上の価値は、抑制したり、a β フィブリノーゲン相互作用を軽減する化合物の開発。どのフィブリンによる血栓形成を簡単かつ体系的に評価する培養方法は、治療化合物の開発の潜在的に有用ツールです。ここに提示すると、a β と β フィブリノーゲンの相互作用阻害剤の効果の解析と同様にフィブリン血栓の生成体外に最適化されたプロトコルです。血栓の濁度測定は急速な再現性の高い、多数 a β フィブリノーゲン阻害剤のスクリーニングを可能にする同時に、複数の条件をテストする使用ことができます。A β による SEM. を使用してフィブリン血栓建築の構造的な異常を改善する能力をこのスクリーニングからヒット化合物をさらに評価できます。これらの最適化されたプロトコルの有効性を TDI-2760、最近同定された a β フィブリノーゲン相互作用阻害剤を使用してここで示します。
Introduction
アルツハイマー病 (AD)、高齢患者における認知機能の低下につながる神経変性疾患主に起こる異常な β アミロイド (a β) 式、集計および神経毒性1,の結果障害クリアランスから2。 a β の凝集体と広告3のよ特徴付けられた協会、にもかかわらず病の病理の基礎となる正確なメカニズムの理解4ではありません。証拠が増えている神経血管障害が進行と広告5の重症度の役割を果たすこと a β は直接循環システム6のコンポーネントと対話します。A β フィブリノーゲン7、は8、AD 患者でマウス モデル9,10,11a β 預金も鈍痛と高親和性の相互作用があります。さらに、線溶9,12への抵抗と同様、異常なフィブリン血栓形成と構造、a β フィブリノーゲンの相互作用を誘導します。循環障害、a β とフィブリノゲン13,14間の相互作用を阻害することによって広告の治療 1 つの治療可能性を軽減すること。我々 は、したがって、高スループット スクリーニングと医薬品化学アプローチ13,14a β フィブリノーゲンの相互作用を阻害するいくつかの小さな化合物を識別されます。A β フィブリノーゲン相互作用阻害剤の有効性をテストするためフィブリン血栓形成の in vitro解析の 2 つの方法を最適化: 濁度分析、走査電子顕微鏡 (SEM)14を凝固します。
血栓濁度測定は、紫外可視分光法を用いたフィブリン血栓形成を監視するための単純明快かつ迅速な方法です。フォーム、光はますますフィブリン血栓として散らばっているし、ソリューションの濁度を増加させます。逆に、a β が存在する場合フィブリン血栓の構造を変更すると、および混合物の濁度が減少 (図 1)。A β による異常から血栓の濁度を復元する潜在的な阻害物質の影響を評価できます。濁度測定は、複数の条件の迅速分析できますが、塊形状と構造に関する限定的な情報を提供します。血栓15,16,17,18 3 D アーキテクチャの方法の評価分析を SEM では、電子プローブによってソリッド オブジェクトの形状が明らかになる可能 a β の存在とあるいは阻害化合物は、その構造9,14を変更します。両方の様々 な目的のために使用されている古典的な実験技術は、SEM 分析法、吸光光度法をアミロイド凝集19,20を監視に使用するたとえば。同様に、SEM は、またパーキンソン病や血栓塞栓性脳卒中患者21,22,23アルツハイマー病のプラズマから形成されるフィブリン血栓を分析する使用されます。ここに示すプロトコルは、再現性と迅速な方法でフィブリン血栓形成の評価に最適です。
次のプロトコルは、体外フィブリン-血栓と a β なしの準備のための手順を提供します。また、フィブリン血栓形成と構造の a β の効果を分析する方法の詳細します。TDI-2760、小さな阻害化合物14を使用して a β フィブリノーゲンの相互作用の阻害を測定するためのこれらの 2 つの方法の有効性を示します。これらのメソッドを個別と一緒はフィブリン血栓形成の in vitroの迅速かつ簡単ですが解析できるように。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、フィブリン血栓形成の in vitro評価の再現性と迅速な手段を提供します。さらに、システムのシンプルさは、フィブリン血栓形成と構造比較的ストレートに a β がどのように影響するかの解釈です。この演習の前の文書で a β フィブリノーゲン相互作用13,14を禁じる機能のための化合物をテストするこれらの試金を使え…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、川崎正憲、和義麻生とトライ機関治療薬探索研究所 (TDI)、a β フィブリノーゲン相互作用阻害剤の合成のためのニューヨークおよび彼らの貴重な提案からマイケル ・ フォーリーをありがとうございます。著者には、役に立つ議論のストリックランド研究室のメンバーもありがとうございました。この作業によって支えられた NIH グラント NS104386、アルツハイマー病の薬発見財団、ロバートソン治療開発基金内接、NIH を与える NS50537、トライ制度治療薬探索研究所アルツハイマー病の薬発見財団ルーディン財団と s. s. のジョン a. ハーマン
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
Riferimenti
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