Análise de expressão genética das células endoteliais expostos para Shear Stress usando múltiplas câmaras de fluxo paralelo-placa
Summary
Aqui, um fluxo de trabalho para a análise de expressão de gene e cultura de células endoteliais sob tensão de cisalhamento fluido é apresentado. Incluído é um arranjo físico para habitação e monitoramento de múltiplas câmaras de fluxo em um ambiente controlado e o uso de um referência exógena do RNA por PCR quantitativo simultaneamente.
Abstract
Descrevemos um fluxo de trabalho para a análise da expressão gênica de células endoteliais, sujeito a um fluxo constante de laminar usando múltiplas câmaras monitoradas fluxo paralelo-placa. As células endoteliais formam o revestimento celular interno dos vasos sanguíneos e são cronicamente expostas para a força de fricção do fluxo de sangue chamado tensão de cisalhamento. Sob condições fisiológicas, a função de células endoteliais na presença de várias condições de tensão de cisalhamento. Assim, a aplicação das condições de tensão de cisalhamento em modelos em vitro pode fornecer maior conhecimento sobre respostas endotelial em vivo. A câmara de fluxo paralelo-placa anteriormente publicada por Lane et al 9 é adaptado para estudar a regulação gênica endotelial na presença e na ausência de fluxo laminar (não-pulsátil) constante. Principais adaptações na configuração para o fluxo laminar, tal como apresentada aqui incluem um ambiente grande, dedicado aos circuitos de casa fluxo simultâneo, o controlo das taxas de fluxo em tempo real e a inclusão de uma referência exógena do RNA para a normalização da dados PCR quantitativos em tempo real. Para avaliar tratamentos/condições múltiplas com a aplicação da tensão de cisalhamento, vários circuitos de fluxo e bombas são utilizadas simultaneamente dentro da mesma incubadora aquecida e umidificada. O caudal de cada circuito de fluxo é medido continuamente em tempo real para padronizar as condições de tensão de cisalhamento ao longo dos experimentos. Porque estas experiências têm várias condições, também utilizamos um RNA exógeno de referência que é cravado no momento da extração do RNA para a normalização da extração do RNA e eficiências de síntese do cDNA da primeiro-costa. Estas etapas minimizam a variabilidade entre as amostras. Esta estratégia é empregada em nosso pipeline para a análise de expressão de gene com tensão de cisalhamento experimentos utilizando a câmara de fluxo paralelo-placa, mas partes desta estratégia, tais como os exógenos referência pico-no RNA, podem facilmente e custos reduzidos a ser usadas para outras aplicações.
Introduction
Vascular em células endoteliais forma o revestimento celular interno dos vasos sanguíneos no sistema cardiovascular fechado de espécies superiores. Eles formam a interface entre o sangue e os tecidos e são caracterizados por luminal e superfícies abluminal. O endotélio é um sistema adaptável, ativo e diversificado que regula o fluxo de sangue, tráfico de nutrientes, imunidade e o crescimento de embarcações de sangue novo1. No corpo, as células endoteliais normalmente existem em um ambiente onde eles são expostos para a força de fricção de circulação, tensão de cisalhamento2. Tensão de cisalhamento é um importante regulador da célula endotelial gene expressão3, e células endoteliais tentam manter a tensão de cisalhamento dentro de um determinado intervalo de2,4. Células endoteliais demonstram angiogênico padronização na ausência de tensão de cisalhamento5 que podem melhorar a perfusão do tecido. Padrões regionais de fluxo perturbado e alterado tensão de cisalhamento estão associados com a expressão de genes inflamatórios6 e o desenvolvimento de aterosclerose7,8. Assim, modelos que incluem a tensão de cisalhamento são um componente importante da compreensão de regulação gênica endotelial.
Nós descrevemos um método para estudar a regulação gênica em células endoteliais vasculares sob tensão de cisalhamento. Este sistema usa fluxo não-pulsátil e imita os níveis de tensão de cisalhamento fluido e concentração de oxigénio que as condições de modelo para as células endoteliais arteriais. Este protocolo inclui detalhes de métodos para o knockdown de gene usando o RNA de interferência (RNAi), o set-up para a aplicação da tensão de cisalhamento com o dispositivo de fluxo paralelo-placa e métodos para o pico-de uma referência exógena do RNA antes da análise por transcriptase reversa quantitativa cadeia da polimerase (RT-qPCR). Esse pipeline é usado para estudar a regulação gênica em células endoteliais na presença e na ausência de tensão de cisalhamento laminar e inclui uma adaptação do aparato de fluxo paralelo-placa descrita por Lane et al 9. esta configuração particular foi projetada para facilitar a avaliação simultânea das várias condições experimentais que permite a comparação direta das condições de tensão de cisalhamento, bem como a normalização de análise de RNA. Uma grande unidade aquecida com umidade controlada é utilizada para permitir que várias câmaras de fluxo separado e bombas para ser executados simultaneamente, com taxas de fluxo monitorizadas para cada conjunto de câmara de fluxo em tempo real. A aplicação desta configuração é usada para knockdown gene usando RNAi na configuração da tensão de cisalhamento/fluxo laminar, mas aspectos do presente protocolo podem ser aplicados a qualquer avaliação da expressão do RNA.
Abordagens comuns para a aplicação da tensão de cisalhamento por células endoteliais incluem microfluidic sistemas10, um viscosímetro cone-placa e11e uma câmara de fluxo paralelo-placa12. Microfluidic sistemas de vários fabricantes tem sido útil no estudo de mechanobiology e mechanotransduction em células múltiplas e tipos de tecido e uma variedade de estímulos biofísicos. Por células endoteliais, eles tem sido usados para estudar células endoteliais em isolamento, bem como a interação de células endoteliais e o tráfico de imune ou tumor de células10. No entanto, estes sistemas são menos adequados para a recuperação de um grande número de células9. O viscosímetro cone-e-placa e câmaras de fluxo paralelo-placa permitam a recuperação de um grande número de células em monocamadas confluente12. Estes sistemas podem gerar uma gama de cisalhamento forças e padrões de12. A câmara de fluxo paralelo-placa montagem9 tem a vantagem essa imagem em tempo real pode ser realizada através da janela de vidro para avaliar a morfologia celular em qualquer ponto do tempo. Além disso, o perfusato pode ser coletado em condições estéreis. Para o sistema aqui apresentado, o fluxo também pode ser monitorado em tempo real e em um set-up multi-câmara, que facilita a manutenção das condições de cisalhamento entre as câmaras.
Para experiências representativas, veia umbilical humana células endoteliais (HUVEC), que representam um tipo de célula endotelial macrovascular, são utilizadas, e as condições de tensão de cisalhamento, usamos (1 Pa) refletem condições arteriais (0,1 – 0,7 Pa). No entanto, este protocolo pode ser usado com outros tipos de células endoteliais, e as condições de tensão de cisalhamento podem ser ajustadas de acordo com a questão experimental. Por exemplo, a avaliação de células endoteliais humanas em condições que o modelo de circulação venosa exigiria mais baixos níveis de tensão de cisalhamento (Pa 1-6) e estudos que o modelo de circulação microvascular utilizaram-se os níveis de tensão de cisalhamento de 0.4 – 1.2 Pa13 , 14. Além disso, a tensão de cisalhamento pode variar mesmo entre células endoteliais dentro do vaso sanguíneo mesmo6. Na configuração atual, é usado um único sistema de monitoramento que pode monitorar simultaneamente quatro loops de fluxo separado. Para laboratórios que precisam de mais fluxo de loops, há espaço no ambiente dedicado para um sistema de monitoramento adicional.
RT-qPCR é usada para a quantificação absoluta de expressão gênica na configuração da tensão de cisalhamento. A expressão relativa dos genes-alvo é frequentemente usada para comparar a expressão do RNA através de condições. Algumas espécies de RNA podem existir em quantidades muito baixas ou estar ausente, complicando assim as medições relativas. Por exemplo, há muito tempo não codificante RNAs em células endoteliais podem exercer efeitos potentes em números relativamente baixos de cópia por célula5. Além disso, as diferenças na eficiência da primeira demão podem levar a uma interpretação imprecisa do utilizando o método de limiar (Ct) do ciclo de delta-delta para analisar os dados. Para resolver esta preocupação, realizamos quantificação absoluta, gerando uma curva de calibração usando uma quantidade conhecida de plasmídeo. Além disso, complementar síntese de DNA (cDNA) é um processo ineficiente, e as diferenças na eficiência do cDNA podem contabilizar diferenças na expressão do RNA entre condições e entre amostras15. A aplicação da tensão de cisalhamento e/ou reagentes de transfecção pode afetar a viabilidade, apoptose e proliferação celular, ou adicionar componentes que podem interferir com a síntese do RNA de isolamento e/ou de cDNA. Para considerar a possibilidade de viés de isolamento de RNA e a síntese do cDNA, usamos um pico-em controlo RNA sintetizados no laboratório, adicionado no momento da extração do RNA e medido com cada cDNA síntese através de RT-qPCR. Isto permite não só o ajustamento técnico diferenças na síntese do RNA de extração e cDNA mas também permite o cálculo das quantidades absolutas por célula, quando a contagem de células é conhecida.
Este sistema utiliza etapas adicionais para manter a similaridade ou esclarecem diferenças técnicas entre as condições. Enfatizamos especialmente estes passos devido à natureza complexa dessas experiências, que envolvem múltiplas instalações físicas e condições experimentais que podem levar à variabilidade experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tensão de cisalhamento é uma condição fisiológica que modula a função endotelial, em parte, por afetar o estado estacionário gene expressão2,5. Modelos de regulação gênica em diferentes condições de tensão de cisalhamento irão contribuir para uma melhor compreensão da função endotelial. Este fluxo de trabalho pragmático inclui um circuito de fluxo utilizando uma câmara de fluxo paralelo-prato adaptada de Lane et al …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela CIHR MOP 142307 ao P.A.M. H.S.J.M. é um destinatário de um canadense institutos de saúde pesquisa programa de treinamento em comunhão de medicina regenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. e M.K.D. são os destinatários da Rainha Elizabeth II bolsas pós-graduação em ciência e tecnologia.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
Riferimenti
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
