联合遗传和化学衣壳改性腺病毒基因转移载体用于屏蔽和靶向
Summary
本文所述的协议使研究人员能够通过简单的化学方法在选定的地点专门修改腺病毒衣壳。可生成屏蔽腺病毒载体颗粒和重定目标基因转移载体, 并可研究载体宿主相互作用。
Abstract
腺病毒载体是基因接种和溶瘤 virotherapy 的有力工具。然而, 它们容易发生多种不希望的载体-宿主相互作用, 特别是在体内分娩后。人们一致认为, 如果对矢量表面进行了定义的修改, 就只能克服不需要的矢量宿主交互所施加的限制。这些修改包括通过引入新配体来屏蔽粒子不需要的相互作用和靶向。这里提出的协议的目标是使读者能够产生屏蔽, 如果需要的话, 重定目标人腺病毒基因转移载体或溶瘤病毒。该议定书将使研究人员通过对合成聚合物、碳水化合物、油脂或其他生物或化学基团的特定化学附着来修改腺病毒载体衣壳的表面。它描述了结合遗传和化学衣壳修饰的尖端技术, 这已被证明有助于理解和克服在体内提供腺病毒载体的屏障。提供了对生物活性病毒或病毒衍生载体执行特定化学反应的关键步骤的详细和注释性描述。该协议中所述的技术是基于基因引入 (自然缺席) 半胱氨酸残留物的溶剂暴露环腺病毒衍生载体。这些半胱氨酸残留物提供了一种特定的化学反应性, 可在产生高滴度的载体后, 用于高度特异和高效的共价键化学耦合分子从各种各样的物质类到向量粒子。重要的是, 该协议可以很容易地适应, 以执行广泛的不同 (非硫醇基) 化学修饰腺病毒载体衣壳。最后, 除了腺病毒以外的非包膜的基因转移载体也可能根据本协议进行修改。
Introduction
腺病毒 (Ad), 家庭 Adenoviridae 的成员, 是未被包围的 DNA 病毒, 迄今已发现超过70种类型 (http://hadvwg.gmu.edu)。根据 hemaglutination 属性、基因组结构和测序结果, 70 种广告类型可分为七种 (人腺病毒 A 至 G)1、2。人类广告基因组的大小为 38 kb, 由秩核衣壳3封装。由于其丰度, 衣壳蛋白六邻体、彭恩碱和纤维都被称为主要衣壳蛋白。最丰富和最大的衣壳蛋白六邻体形成20衣壳面, 每个构成12六邻体 homotrimers4,5。彭恩位于每个秩边缘 (顶点) 上, 由彭恩基 pentamers 组成, 表示由糖化纤维三聚体5、6构建的顶点尖峰的基部。本机 Ad 单元格条目基本上由两个主要步骤组成。首先, 纤维旋钮与主受体结合。在种类 A、C、E 和 F 的广告类型中, 这是柯萨奇和腺病毒受体 (汽车)。这种相互作用使 virion 进入细胞表面的空间接近, 从而促进彭恩基细胞整合素和 RGD 图案之间的相互作用, 从而诱导细胞反应。第二, 细胞骨架的变化导致 virion 的内部化和运输到缔7。在缔中进行部分拆卸后, virion 被释放到细胞质中, 最终会传播到细胞核进行复制。
虽然可以在本地交付 Ad (例如, 用于基因接种), 但 onco virotherapy 所需的血液系统传递面临几个障碍。在血液循环中, 注射病毒会遇到宿主免疫系统的防御系统, 导致病毒载体的快速中和, 以及在系统应用中呈现基于 Ad 的矢量极低效率。此外, 广告的自然经干扰系统交付, 必须解决, 将广告重定向到其新的目标细胞。
种系编码的天然 IgM 抗体的先天免疫系统迅速识别和绑定高度重复的结构在表面上的 virion8,9。这些免疫复合体然后激活补充系统的经典和非经典通路, 导致快速补充-介导的病毒8的大部分的中和。第二条途径导致主要去除 Ad 病毒由巨噬细胞10介导, 并与急性毒性和血流动力学副作用11,12。特别是在 Ad 的情况下, 枯否细胞驻留在肝脏绑定到和 phagocytically 采取病毒通过特定的清道夫受体的广告, 从而消除他们从血液13,14,15.在肝窦内皮细胞 (lse 细胞)16中也发现了特定的清道夫受体, 而 LSE 细胞也似乎有助于去除17的矢量, 但在多大程度上仍需要澄清。此外, 一些广告类型和他们的衍生载体被有效地隔离的人红细胞18 , 他们通过汽车或补充受体 CR119捆绑。值得注意的是, 这种螯合机制不能在小鼠模型系统中研究, 因为与人红细胞相比, 小鼠红细胞不表示汽车。
自适应免疫系统产生的特定抗 ad 抗体, 无论是由于以前的感染与 ad 或在系统应用的第一次交付后, 对广告载体的有效使用提出了进一步的障碍, 他们应该回避在高效的系统交付。
最后, 一些广告类型 (包括 Ad5) 的强势经严重阻碍了广告在系统性治疗中的应用。这种取向导致肝细胞转导是由于 ad virion 对凝血因子 X (fx) 的高度亲和力, 由 fx 与 Ad 六邻体蛋白20、21、22的相互作用介导。FX 桥 virion 肝素硫酸盐聚糖 (HSPGs) 在肝细胞的表面20,23,24,25。这种相互作用的一个关键因素似乎是肝细胞中 HSPGs 的 n-和邻硫酸化的具体程度24, 与其他细胞类型的 HSPGs 不同。除了这种 FX 介导的途径, 最近的研究表明, 进一步的途径尚未确定, 导致肝细胞的 Ad 转导26,27,28。
最近, 研究表明, FX 不仅涉及 Ad 的肝细胞转导, 而且通过结合, virion 屏蔽病毒颗粒对中和的补充系统26。减少肝细胞转导通过防止 FX 结合, 因此, 将产生不必要的副作用, 增加 Ad 中和通过先天免疫系统。
因此, 有必要深入了解载体和宿主生物体之间的复杂相互作用, 以便为系统应用开发更有效的载体, 以规避宿主有机体施加的障碍。
最初用于治疗蛋白的一种策略已经适应了广告载体, 至少部分克服了上面描述的障碍。通过偶联聚乙烯乙二醇 (PEG)29、30, 可降低治疗蛋白化合物的抗原性和免疫原化。因此, 聚合物如 PEG 或聚 [n-(2-羟丙基) methacrylamid] (pHPMA) 与衣壳表面的共价耦合会保护载体免受不需要的矢量-宿主相互作用。通常, 聚合物耦合靶向在壳体表面随机分布的赖氨酸侧残留物中的ε胺基团。溶液中的矢量粒子是由于附着聚合物的亲水性, 被稳定的水壳所包围, 从而降低了免疫细胞识别或酶降解的风险。此外, 聚乙二醇 Ad 载体被证明在体外和免疫前小鼠体内的抗六邻体抗体, 以逃避中和31。与遗传衣壳的修改相反, 聚合物的化学耦合在生产和纯化后进行, 不仅允许使用传统的生产者细胞和生产高滴度向量种群, 而且还用于同时在衣壳表面上对数以千计的氨基酸进行修改。然而, 胺导向屏蔽在整个衣壳表面随机发生, 导致高异构性问题, 不允许修改特定 capsomers。此外, 所需的大聚合物基团对病毒生物活性的影响32。
为了克服这些局限性, Kreppel等。33引入了合作-化学概念, 用于矢量重定位和去靶化。半胱氨酸是基因引入到病毒衣壳在溶剂暴露的位置如纤维高环路33, 蛋白 IX34, 和六邻体35,36。虽然不是自然发生的, 但半胱氨酸的 Ad 载体可以在正常生产者细胞中以高滴度产生。重要的是, 在某一 capsomer 中插入半胱氨酸在某些 capsomers 和不同位置允许对硫醇基团反应基团进行高度特异的修改。这种合作的方法已经被证明克服了广告矢量设计中的许多障碍。结合胺基聚乙二醇化不再瞄准目标和硫醇基的转铁蛋白与纤维旋钮高环路的耦合已被证明成功地将修改后的广告载体重新定位到缺汽车的细胞33。由于六邻体参与了最不需要的相互作用 (中和抗体, 凝血因子 FX), 硫醇基改性策略也应用于六邻体。耦合小 peg 基团到 HVR5 六邻体阻止 Ad 矢量粒子传感器 SKOV-3 细胞存在 FX, 而大 PEG 基团增加肝细胞转导14,35。在纤维旋钮中载有突变的 Ad 矢量粒子抑制了汽车的束缚和 HVR7 抑制了 FX 的束缚 (在 HVR1 中插入半胱氨酸的位置特定的聚乙二醇化), 以逃避抗体和补充介导的中和,以及清道夫受体介导的摄取而不丧失传染性。有趣的是, 尽管缺乏天然的 FX 盾, 聚乙二醇化再次改善肝细胞转导为 PEG 大小36的功能。然而, 结果表明, 共价屏蔽确实对细胞内的贩运过程产生了影响。造粒等。比较了基于 pHPMA 的不可逆和 bioresponsive 屏蔽, 表明屏蔽和共聚合电荷的模式对细胞进入有影响, 但对细胞核的微粒贩运也有影响。采用带有正电荷的 pHPMA 共聚合物的 bioresponsive 盾, 允许粒子在细胞核内进行颗粒物贩运, 在体外和体内保持 Ad 载体的高转导效率37。
总之, 这些数据表明, 即使在假设所有的矢量-主机-相互作用已知和考虑, 过多的衣壳表面修改是必要的, 以克服与系统向量传递相关的障碍。
在这里, 我们提供了一个协议, 以执行特定于站点的化学修饰腺病毒载体衣壳屏蔽和/或重定向腺病毒载体颗粒和腺病毒溶瘤病毒。图 1概述了该技术的概念。它允许某些衣壳区域免受不必要的相互作用的合成聚合物的共价键连接。同时, 它还提供了一种连接配体并结合屏蔽和定位的方法。使用简单的化学, 实验者将能够共价修改腺病毒载体表面与各种分子, 包括多肽/蛋白质, 碳水化合物, 油脂, 和其他小分子。此外, 该议定书为生物活性病毒源载体在维持其生物学完整性和活性方面的化学修饰提供了一个一般概念。
Protocol
Representative Results
Discussion
基因引入半胱氨酸的效率通常为 80-99%, 而某些变量会影响这种效率。首先, 最重要的是, 基因引入的半胱氨酸不会过早氧化。在生产者细胞的还原环境中得到良好保护的同时, 在化学修饰过程中释放载体颗粒后, 必须提供非氧化环境。为此, 减少试剂可用于浓度从 0.1-10 毫米, 并有必要使用还原试剂, 不含硫醇基团, 这将容易与马来酰亚胺活性化合物反应。其次, 当使用马来酰亚胺活化化合物时, ph 值在…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
Riferimenti
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, 570-573 (1953).
- van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
- Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
- Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
- Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
- Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
- Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
- Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
- Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
- Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
- Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
- Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
- Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
- Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
- Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
- Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
- Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
- Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
- Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
- Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
- Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
- Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
- Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
- O’Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
- Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
- Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
- Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
- Prill, J. -. M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
- Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. , 377-388 (2017).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).
