Combinate le modifiche genetiche e chimiche del Capsid di vettori basati su Adenovirus Gene Transfer per schermatura e Targeting

Summary

Il protocollo descritto qui consente ai ricercatori di modificare specificamente capsidi adenovirus su siti selezionati dalla chimica semplice. Schermato adenovirus vettori particelle e gene bersagliamento trasferimento vettori possono essere generati, e interazioni ospite vettoriale possono essere studiati.

Abstract

L'adenovirus vettori sono potenti strumenti per Oncolitica di vaccinazione e oncolytic genetica. Tuttavia, sono inclini a più interazioni indesiderate vettore-ospite, soprattutto dopo la consegna in vivo . È un consenso che i limiti imposti dalle interazioni indesiderate vettore-ospite possono solo essere superata se vengono eseguite modifiche definite della superficie vettoriale. Tali modifiche includono targeting tramite l'introduzione di nuovi ligandi e schermatura delle particelle da interazioni indesiderate. L'obiettivo del protocollo presentato qui è quello di consentire al lettore di generare schermato e, se lo si desidera, reindirizzati adenovirus umano gene transfer vettori o virus oncolitici. Il protocollo consentirà ai ricercatori di modificare la superficie di capsidi vettoriale dell'adenovirus da allegato specifico chimica di polimeri sintetici, carboidrati, lipidi o altre molecole biologiche o chimiche. Esso descrive la tecnologia all'avanguardia di modifiche combinato del capsid genetica e chimica, che sono stati indicati per facilitare la comprensione e il superamento delle barriere per la consegna in vivo di vettori dell'adenovirus. Viene fornita una descrizione dettagliata e commentata delle fasi cruciali per l'esecuzione di specifiche reazioni chimiche con virus biologicamente attivi o vettori derivati dal virus. La tecnologia descritta nel protocollo si basa sull'introduzione genetica della cisteina (naturalmente assente) residui in solvente-esposti cicli di vettori derivati dell'adenovirus. Questi residui di cisteina forniscono una specifica reattività chimica che, dopo la produzione dei vettori per gli alti titoli, è utilizzabile per altamente specifico ed efficiente accoppiamento chimico covalente di molecole da una vasta gamma di classi di sostanze al vettore particelle. D'importanza, questo protocollo può essere facilmente adattato per eseguire un'ampia varietà di differenti modificazioni chimiche (non-tiolo-base) di capsidi vettoriale dell'adenovirus. Infine, è probabile che vettori di trasferimento non capsulati genica basati su virus diverso da quello dell'adenovirus può essere modificato dalla base del presente protocollo.

Introduction

Adenovirus (annuncio), membri della famiglia Adenoviridae, sono virus a DNA senza involucro di cui più di 70 tipi finora sono stati identificati (http://hadvwg.gmu.edu). Seconda hemaglutination proprietà, struttura del genoma e risultati di sequenziamento, i tipi di 70 annunci possono essere diviso in sette specie (Adenovirus umano A G)^1,2. Il genoma umano di annuncio è di 38 kb e incapsulato da un nucleocapside icosahedral³. A causa della loro abbondanza, il hexon di proteina del capside, penton base e fibra sono tutti appresso proteine del capside principali. Il hexon di proteine più ....

Protocol

Nota: In seguito, un protocollo per la PEGilazione geneti-chimico di un annuncio di vettore è descritto al dettaglio. Per attivare specifico accoppiamento della parte di PEG, un vettore di Ad5 in anticipo era geneticamente modificato dall'introduzione di un residuo di cisteina nella proteina hexon al loop ipervariabili 5 come descritto in una precedente pubblicazione³⁶e un piolo maleimide-attivato composto è utilizzato come composto di accoppiamento.

1. preparazione del buffer per la purificazione di vettore dai gradienti di CsCL passo

1. Preparare 400 mL di buffer di Adenovirus (annuncio-buffer) aggiungendo 5....

Results

Nella figura 2 vengono illustrati esempi dell'effetto citopatico (CPE) su 293 cellule (HEK 293) che indica la produzione di successo vettoriale. Le cellule dovrebbero mostrare morfologia (Figura 2) 40-48 ore dopo l'inoculazione con il vettore di virus. Timepoint giusto per la raccolta è fondamentale per non perdere le particelle del virus di lisi cellulare e impedendo l'ossidazione dei gruppi tiolici geneticamente introdotto. Se .......

Discussion

L'efficienza con cui le cisteine geneticamente introdotte possono essere modificate chimicamente è in genere 80-99%, e determinate variabili influenzano questa efficienza. In primo luogo, è fondamentale che le cisteine geneticamente introdotte non subiscono l'ossidazione prematura. Pur essendo ben protetto in ambiente riducente delle cellule del produttore, è obbligatorio fornire un ambiente non ossidativo dopo rilasciando particelle di vettore dalle cellule di produttore e durante la modificazione chimica. A tal fine, r.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purificazione vettoriale e modifica chimica
Gas Argon Air	liquide	rivenditore
Azoto liquido	Air liquide	rivenditore locale di gas
500 mL provette per centrifuga	Corning	431123
Stericup Express Plus 0.22 &; m	Millipore	SCGPU02RE
Tris(2-carbossietil) fosfina (TCEP)	Sigma-Aldrich	C4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (siringhe)	Henke Sass Wolf	4020.000V0
Fine-Ject aghi monouso (giallo 0,9 x 40 mm)	Henke Sass Wolf	4710009040
Cloruro di cesio 99,999% Ultra Quality	Roth	8627.1
Perle di gel di silice	Applichem	A4569.2500
Metossipolietilenglicole maleimmide - 750 (PEG mal-750)	Iris Biotech		negozio in perle di gel di silice a -80 ° C
13,2 mL Provette per ultracentrifuga ultra trasparenti	Beckman Coulter	344059	aperto solo in cappa
Colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale PD-10	GE Healthcare	17-0851-01	conservare a 4 ° C
Hepes	AppliChem	A1069.1000
SDS Ultrapure	AppliChem	A1112,0500
Glicerolo	AppliChem	A1123.1000
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Materiale per colture cellulari
DPBS	PAN Biotech	P04-36500
DMEM	PAN Biotech	P04-03590
Tripsina/EDTA	PAN Biotech	P10-0231SP
FBS Good	PAN Biotech	P40-37500
Penicillina/Streptomicina	PAN Biotech	P06-07100
Puntali con filtro a biosfera (varie dimensioni)	Sarstedt
(varie dimensioni)	Provette di reazione Sarstedt
(varie dimensioni)	Piastre TC Sarstedt
15 cm	Sarstedt	83.3903
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Materiale per il protocollo di colorazione dell'argento
Metanolo	J.T.Baker	8045
Etanolo assoluto	AppliChem	1613,2500PE
Acido acetico	AppliChem	A0820,2500PE
Formaldeide 37%	AppliChem	A0877,0250
Etanolo assoluto	AppliChem	A1613,2500PE
Tiosolfato di sodio	AppliChem	1,418,791,210
Nitrato d'argento	AppliChem	A3944.0025
Carbonato di sodio	AppliChem	A3900,0500<
strong>Nome	Company	Numero catalogo	Comments
Attrezzature da laboratorio speciali
Essiccatore	Nalgene	5311-0250
Megafuge 40	Heraeus
Roter per Megafuge TX750 + Adattatore e coperchi per provette da 500 mL	Heraeus
Bagnomaria
es. Optima XPN-80	Coltro
Beckman adatto Ultrazentrifuge Rotor es. SW41	Beckman Coulter
pH-Meter	Convenzionale
Supporto con morsetti	Convenzionale Lampada
collo d'oca	Convenzionale
Rotore sopraelevato	Convenzionale
Fotometro convenzionale a blocchi
(OD 260)	Convenzionale