차폐 및 타겟팅에 대 한 유전과 화학 Capsid 수정 아 데 노비 루스 기반 유전자 전달 벡터의 결합
Summary
여기에 설명 된 프로토콜 연구자를 특별히 선택 된 사이트에 아 데 노비 루스 capsids 간단한 화학 수정에 있습니다. 차폐 된 아 데 노 바이러스 벡터 입자 대상이 유전자 전달 벡터 생성 될 수 있습니다, 그리고 벡터 호스트 상호 작용은 공부 될 수 있다.
Abstract
아 데 노 바이러스 벡터는 유전자 백신 접종과 oncolytic virotherapy 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 그들은 특히 vivo에서 배달 후 여러 원치 않는 벡터-호스트 상호 작용 하는 경향이 있다. 정의 된 벡터 표면 수정 수행 하는 경우 원치 않는 벡터-호스트 상호 작용에 의해 부과 된 제한 에서만 수 합의 극복할 수입니다. 이러한 수정에는 원치 않는 상호 작용에서 입자의 차폐 및 새로운 ligands의 도입에 의해 대상으로 포함 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜의 목표 생성 하 리더를 사용 하는 차폐 하 고, 원하는 경우, 인간의 아 데 노 바이러스 유전자 전달 벡터 또는 oncolytic 바이러스 대상이 변경. 프로토콜에는 아 데 노 바이러스 벡터 capsids 표면 합성 고분자, 탄수화물, 지질, 또는 다른 생물학 또는 화학 moieties의 특정 화학 첨부 하 여 수정 하는 연구자 수 있게 된다. 이해 고의 비보에 아 데 노 바이러스 벡터의 배달에 대 한 장벽을 극복 하 보였다 결합 된 유전과 화학 capsid 수정의 최첨단 기술을 설명 합니다. 생물학적으로 활성 바이러스 또는 바이러스 유래 벡터가 특정 화학 반응을 수행 하기 위한 중요 한 단계는 상세 하 고 주석 설명 제공 됩니다. 프로토콜에서 설명 하는 기술 (자연스럽 게 결 석) 시스테인의 유전자 도입에 따라 파생 하는 아 데 노 바이러스 벡터의 솔벤트 노출 반복으로 잔류물. 이 시스테인 잔류물, 높은 titers 벡터의 생산, 후 악용 될 수 있는 매우 특정 하 고 효율적인를 벡터 다양 한 물질 클래스에서에서 분자의 화학식 화학 결합에 대 한 특정 화학 반응성을 제공 입자입니다. 중요 한 것은,이 프로토콜 아 데 노 바이러스 벡터 capsids의 다른 (비-thiol 기반) 화학 수정의 광범위 한 다양 한 수행 하 쉽게 적응 될 수 있다. 마지막으로, 그것은 가능성이 그 비 싸여 바이러스 기반 유전자 전달 벡터 보다 다른이 프로토콜의 기초에서 아 데 노 바이러스를 수정할 수 있습니다.
Introduction
Adenoviruses (광고), Adenoviridae, 가족의 구성원은 비 싸여 DNA 바이러스의 70 이상 종류를 지금까지 확인 된 (http://hadvwg.gmu.edu) 되었습니다. Hemaglutination 속성, 게놈 구조 및 시퀀싱 결과 따라 70 광고 종류 7 종 (인간의 adenoviruses g A)1,2로 나눌 수 있습니다. 인간의 광고 게놈 크기에서 38 kb 이며 icosahedral nucleocapsid3에 의해 캡슐. 그들의 풍부 때문에 capsid 단백질 hexon, penton 기지와 섬유는 모두 라고 하 주요 capsid 단백질. 가장 풍부 하 고 큰 capsid 단백질 hexon 12 hexon homotrimers,45의 구성 된 각 20 capsid 측면을 형성 한다. 펜 톤, 각 icosahedral 가장자리 (정점)에 있는 펜 톤 베이스의 pentamers의 구성 되어 있으며 당화 섬유 trimers5,6의 내장 된 버텍스 스파이크에 대 한 자료를 나타냅니다. 기본 광고 셀 항목 기본적으로 두 가지 주요 단계로 구성 됩니다. 첫째, 섬유 손잡이 기본 수용 체에 바인딩합니다. A, C, E 및 F 종에서 광고 종류, 콕 사키와 아 데 노비 루스 수용 체 (차)입니다. 이 상호 작용 함으로써 기본 펜 톤에 따라서 유도 세포 응답 셀룰러 integrins와 RGD 모티브 간의 상호 작용을 촉진 셀 표면의 공간 근접으로는 virion을 제공 합니다. 둘째, 골격에 변화 virion endosome7전송의 국제화 이어질. 출시는 virion는 endosome의 부분 분해 시 세포질에 및 궁극적으로 복제에 대 한 핵에 여행.
동안 광고를 로컬로 배달 될 수 있다 (예., 유전 접종), onco-virotherapy에 필요한 혈 류를 통해 조직의 배달 여러 장벽에 직면. 혈 류에서 순환 하는 동안 삽입 된 virions 숙주의 면역 체계, 바이러스 기반 벡터의 빠른 중립화를 선도 하 고 조직의 응용 프로그램에 매우 비효율적인 광고 기반 벡터 렌더링의 방어 시스템을 발생 합니다. 또한, 광고의 자연 hepatotropism 체계 납품을 방해 하 고 그것의 새로운 대상 셀에 광고를 확인 해야 합니다.
생식 인코딩 자연 IgM 항 체는 타고 난 면역 시스템의 신속 하 게 인식 하 고 virion8,9의 표면에 매우 반복적인 구조를 바인딩합니다. 이 면역성이 있는 복합물을 빨리 보완-중재 무력화 virions8의 큰 부분으로 이끌어 보완 시스템의 클래식과 비 클래식 경로 활성화. 광고 virions의 주요 제거의 결과로 두 번째 통로10 대 식 세포 의해 중재 및 급성 독성 및 haemodynamic 부작용11,12. 광고의 경우 특히, Kupffer 세포 간에 바인딩할 및 phagocytically 광고 virions 통해 특정 폐품 수용 체, 그로 인하여 채택 그들에서 제거는 혈액13,14,15 . LSE 셀 또한 벡터 제거17, 하지만 어느 정도 여전히 명확한 필요에 기여 하는 것와 특정 폐품 수용 체는 또한 간 사인 내 피 세포 (LSE)16에 발견 되었습니다. 또한, 일부 광고 종류와 그들의 파생된 벡터 효율적으로 인간의 적혈구18 에 그들은 바인딩 통해 자동차 또는 보완의 수용 체 CR119에 의해 격리 됩니다. 참고,이 봉쇄 메커니즘 인간의 적혈구에 대조에서 마우스 모델 시스템에서 공부 될 수 없습니다, 그리고 마우스 적혈구 자동차를 표현 하지 않습니다.
특정 안티 광고 항 체 적응 면역 시스템에 의해 생성 된 광고 중 광고와 함께 이전 감염 때문에 노출 후 또는 조직의 응용 프로그램에 첫 번째 배달 후 광고 벡터의 효과적인 사용을 더 방 벽 올리고 그들에 피할 해야 합니다. 효율적인 조직 배달 합니다.
마지막으로, 광고 종류의 (를 포함 하 여 Ad5) 심각 하 게 강한 hepatotropism 응용 프로그램 광고의 조직 치료에 방해가 됩니다. 이 차 있는 굴곡이 운동 hepatocyte 변환 결과 혈액 응고 요인 X (FX), 광고 hexon 단백질20,,2122와 FX의 상호 작용에 의해 중재를 광고 virion의 높은 선호도 때문 이다. FX는 hepatocytes20,23,,2425의 표면에 헤 파 린 황산 염 glycans (HSPGs)에 virion 교량. 이 상호 작용에 대 한 중요 한 요소는 다른 세포 유형에 HSPGs에서 별개의 N-및 O-sulfation 간세포24, HSPGs의 특정 정도 될 것으로 보인다. 이 FX 중재 통로, 뿐만 아니라 최근의 연구 추가 경로 아직 hepatocytes26,,2728의 Ad 변환에 그 결과 확인 것이 좋습니다.
최근에, 그것은 보였다 FX 광고, hepatocyte 변환에만 관여 하지 않습니다 하지만 또한 바인딩, 여는 virion 중화에 대 한 바이러스 입자 방패 보완 시스템26여. FX 바인딩 방지 하 여 hepatocyte 변환의 감소 따라서 것 만들 광고 중화를 통해 증가의 원치 않는 부작용 타고 난 면역 계통.
벡터와 호스트 유기 체 사이의 복잡 한 상호 작용의 깊은 지식을 따라서 호스트의 유기 체에 의해 부과 하는 장애물을 회피 하는 조직의 응용 프로그램에 대 한 보다 효율적인 벡터를 개발 하는 데 필요한입니다.
원래 치료 단백질을 위해 사용 된 1 개의 전략은 적어도 부분적으로 위의 기술된 장벽을 극복 하기 위해 광고 벡터에 대 한 적응 되었습니다. Antigenicity와 immunogenicity 치료 단백질 화합물의 결합 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)29,30감소 될 수 있습니다. 따라서, 말뚝 등 폴 리 [N-(2-여기) methacrylamid] 고분자의 화학식 커플링 (pHPMA)는 capsid를 표면 보호 원치 않는 벡터-호스트 상호 작용에서 벡터. 일반적으로, 중합체는 capsid 표면에 무작위로 배포 되는 리 사이드 잔류물에서 대상 ε-아민 그룹을 결합 하는. 솔루션에서 벡터 입자, 연결 된 고분자의 친수성 특성상 둘러싸여 면역 세포 인식 또는 효소 저하의 위험을 줄이고 안정적인 물 쉘. 또한, PEGylated 광고 벡터 안티-hexon 항 체에서 생체 외에서 그리고 vivo에서미리 면역된 생쥐31중립화를 피하기 위해 보였다. 유전 capsid 수정, 달리 고분자의 화학 결합은 수행 생산 및 정화, 동시 뿐만 아니라 기존의 프로듀서 셀 및 높은 titer 벡터 주식의 뿐만 아니라 생산의 사용을 허용 capsid 표면에 아미노산의 수천의 수정. 그러나, 높은 heterogeneities에 확장 하 고 특정 capsomers의 수정에 대 한 허용 하지, 전체 capsid 표면에 걸쳐 무작위로 발생 차폐 아민 감독 합니다. 또한, 유익한 효과에 필요한 대형 폴리머 moieties 바이러스 bioactivity32손상.
이러한 한계, Kreppel 외극복 한다 33 벡터 다시-와-타겟팅에 대 한 geneti-화학 개념을 도입 했다. 시스테인 유전자 섬유가 루프33, 단백질 IX34및 hexon35,36같은 용 매에 노출 된 위치에 바이러스 capsid로 소개 되었다. 비록 하지 자연스럽 게 발생, 시스테인 베어링 광고 벡터 정상 프로듀서 셀에서 높은 titers에서 생산 수 있습니다. 중요 한 것은, 삽입 단일 capsomer 내의 다른 위치에 특정 capsomers에 시스테인의 thiol 그룹 반응 moieties의 매우 구체적인 수정 할 수 있습니다. Geneti-화학 이렇게 광고 벡터 디자인에 수많은 장애물을 극복 하기 위해 표시 되었습니다. Detargeting 및 섬유 노브이 루프 입증 된 성공적으로 대상을 수정 자동차 불충분 한 세포33광고 벡터 처리가의 thiol 기반 결합 아민 기반 PEGylation의 조합입니다. Hexon는 (중화 항 체, 혈액 응고 인자 FX) 가장 원치 않는 상호 작용에 관여 하 고, 이후 thiol 기반 수정 전략 hexon에도 적용 했다. Hexon의 HVR5에 작은 말뚝 moieties 커플링 큰 말뚝 moieties hepatocyte 변환14,35증가 하는 반면 광고 벡터 입자 transduce SKOV-3 셀 FX, 존재를 방지. 광고 벡터 입자 섬유 손잡이 자동차 바인딩 억제 및 FX (및 위치-특정 PEGylation 위한 HVR1에 삽입 베어링 시스테인)의 HVR7 억제 바인딩 돌연변이 나르는 중화 항 체와 보충 중재를 피하기 위해 보였다 뿐만 아니라, infectivity의 손실 없이 폐품 수용 체-중재 통풍 관. 흥미롭게도, 자연 FX 방패의 부족에도 불구 하 고 PEGylation 다시 향상 hepatocytes의 변환 못 크기36의 기능으로. 그러나, 그것을 세포내 매매 프로세스에 영향을 미칠지 않습니다 공유 차폐 표시 했다. Prill 외. pHPMA에 기반 하 고 차폐도 공동 폴리머의 어느 모드 셀 항목에 영향을 했다 하지만 입자 핵을 인신 매매에 영향을 증명 bioresponsive 방패 대 돌이킬 수 없는 비교. 긍정적으로 위탁된 한 pHPMA 공동 폴리머 입자 광고의 높은 변환 효율성을 유지 하는 핵을 인신 매매에 대 한 허용으로 bioresponsive 방패를 고용 생체 외에서 그리고 vivo에서37벡터 스
요약 하자면, 이러한 데이터 나타냅니다, 모든 벡터 호스트 상호 작용 알려져 하 고 고려 했다 가정 에서도 과도 한 capsid 표면 수정 관련 조직의 벡터 배달 된 장애물을 극복 하는 데 필요한.
여기 우리는 차폐 및 oncolytic 아 데 노비 루스 기반 바이러스 및 아 데 노 바이러스 벡터 입자의 retargeting 아 데 노 바이러스 벡터 capsids의 사이트별 화학 수정 작업을 수행 하는 프로토콜을 제공 합니다. 이 기술의 개념은 그림 1에 설명 되어. 합성 고분자의 공유 첨부 파일에 의해 원치 않는 상호 작용에서 capsid 지역 특정의 차폐 수 있습니다. 동시, ligands를 연결 하 고 차폐 및 대상으로 하는 수단을 제공 합니다. 간단한 화학을 사용 하 여, 경험 covalently 수정 아 데 노 바이러스 벡터 표면 분자 펩 티 드/단백질, 탄수화물, 지질를 포함 하 여 및 다른 작은 분자의 다양 한 수 있을 것입니다. 또한, 프로토콜은 그들의 생물 학적 무결성 및 활동의 유지 관리에서 생물학적으로 활성 바이러스 파생 벡터의 화학 수정에 대 한 일반적인 개념을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유전자 도입된 시스테인 수정할 수 있습니다 화학적 효율은 일반적으로 80-99%, 그리고 특정 변수가이 효율에 영향을 미칠. 첫째, 그것은 파라마운트 유전자 도입된 시스테인 조기 산화를 받게 하지 않습니다. 프로듀서 셀의 환 환경에서 잘 보호 되 고, 하는 동안 그것은 화학 수정 동안 프로듀서 셀에서 벡터 입자를 해제 한 후 비 산화 환경 제공 하기. 이 위해 시 약을 줄이고 0.1-10 mM에서 농도에서 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
Riferimenti
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