Kombinert genetiske og kjemiske kapsid modifikasjoner av Adenovirus-baserte genoverføring vektorer for skjerming og målretting
Summary
Protokoll beskrevet her kan forskere spesielt endre adenovirus capsids på utvalgte områder av enkel kjemi. Skjermet adenovirus vektorer partikler retargeted gene overføring vektorer kan genereres og vektor vert interaksjoner kan studeres.
Abstract
Adenovirus vektorer er potent verktøy for genetisk vaksinasjon og kan virotherapy. Men er de utsatt for flere uønskede vektor-vert samspill, spesielt etter i vivo levering. Det er konsensus at begrensningene pålagt av uønskede vektor-vert interaksjoner kan bare overvinnes hvis definerte modifikasjoner av vektor overflaten er utført. Disse endringene inkluderer skjerming partikler fra uønsket interaksjon og målretting etter innføring av nye ligander. Målet med protokollen presenteres her er å aktivere leseren til å generere skjermet og, hvis ønskelig, retargeted menneskelige adenovirus gene overføring vektorer eller kan virus. Protokollen lar forskere å endre overflaten av adenovirus vector capsids ved bestemte kjemiske vedlegg av syntetiske polymerer, karbohydrater, lipider eller andre biologiske eller kjemiske moieties. Den beskriver den banebrytende teknologien kombinert genetiske og kjemiske kapsid endringer, som har vist seg å lette forståelsen og overvinne av barrierer i vivo levering av adenovirus vektorer. En detaljert og kommentert beskrivelse av avgjørende trinn for å utføre bestemte kjemiske reaksjoner med biologisk aktive virus eller virus-avledet vektorer er gitt. Teknologien beskrevet i protokollen er basert på genetisk innføring av (naturlig tilstede) cystein rester i løsemiddel-eksponerte ledd av adenovirus-avledet vektorer. Disse cystein rester gi en bestemt kjemiske reaktivitet som kan, etter produksjon av vektorer til høy titers, utnyttes for spesifikke og effektiv kovalente kjemiske kopling av molekyler fra en rekke stoff klasser til vektor partikler. Viktigere, kan denne protokollen enkelt tilpasses for å utføre et bredt spekter av forskjellige (ikke-thiol-baserte) kjemiske modifikasjoner av adenovirus vector capsids. Til slutt, er det sannsynlig at ikke-innhyllet virus-basert genet overføring vektorer annet enn adenovirus kan endres fra grunnlaget for denne protokollen.
Introduction
Adenoviruses (Ad), medlemmer av familien Adenoviridae, er ikke-innhyllet DNA virus som mer enn 70 typer så langt har vært identifisert (http://hadvwg.gmu.edu). Avhengig av hemaglutination egenskaper, genomet struktur og sekvensering resultater, kan 70 annonsetypene deles inn i syv arter (menneskelige adenoviruses A til G)1,2. Det menneskelige genomet annonsen er 38 kb inne størrelse og innkapslet av en icosahedral nucleocapsid3. På grunn av sin overflod kalles kapsid protein hexon, penton base og fiber alle store kapsid proteiner. Den mest rikelig og største kapsid protein hexon danner 20 kapsid fasetter, hver bestående av 12 hexon homotrimers4,5. Penton, ligger icosahedral kanten (toppunkt), består av pentamers av penton base og representerer en base for vertex topp som bygges glycosylated fiber trimers5,6. Den opprinnelige annonsen celleoppføring består i utgangspunktet av to hovedtrinn. Først binder knotten fiber til primære reseptoren. I annonsetyper fra arter A, C, E og F er coxsackie og adenovirus reseptoren (bil). Dette samspillet bringer virion i romlig nærhet til celleoverflaten, og dermed tilrettelegge for samspill mellom mobilnettet integrins og RGD-motiv i penton base og dermed indusere mobilnettet svar. Andre endringer i cytoskeleton føre til internalisering virion og transport til endosome7. Ved delvis demontering i endosome, virion slippes til cytoplasma und slutt reiser til kjernen for replikering.
Mens annonsen leveres lokalt (f.eks., for genetisk vaksinasjon), systemisk levering gjennom blodet som kreves for onco-virotherapy ansikter flere barrierer. Mens sirkulerer i blodet, møte injisert virions forsvar av vertens immunsystemet, fører til rask nøytralisering av virus-basert vektorer og gjengivelse Ad-basert vektorer ekstremt ineffektiv i systemisk programmer. Videre den naturlige hepatotropism annonse forstyrrer systemisk levering og må løses omadressere annonsen til sin nye målcellene.
Germline-kodet naturlig IgM antistoffer av det medfødte immunsystemet raskt gjenkjenner og binder svært repeterende strukturer på overflaten av virion8,9. Disse immun komplekser aktivere klassisk og ikke-klassiske veier av komplement systemet, fører til rask komplement-mediert nøytralisering av en stor del av virions8. En andre sti som fører til store fjerning av annonsen virions er formidlet av makrofager10 og forbundet med akutt bivirkninger11,12-med giftig og hemodynamiske. I annonsen spesielt eliminere Kupffer celler i leveren binde til og phagocytically ta opp Ad virions via bestemte åtseldyr reseptorene, og dermed dem fra det blod13,14,15 . Bestemt åtseldyr reseptorer også identifisert på leveren sinusformet endotelceller (LSE celler)16, og LSE cellene også synes å bidra til vektor eliminering17, men til hvilken grad fortsatt trenger avklaring. Videre er enkelte annonsetyper og deres avledet vektorer effektivt sequestered av menneskelig erytrocytter18 som de binder via bil eller supplement reseptoren CR119. Av notatet, denne sequestering mekanismen kan studeres i mus modell systemet i kontrast til menneskelig erytrocytter, musen erytrocytter uttrykke ikke bil.
Spesifikke anti-annonse antistoffer generert av adaptive immunsystemet etter eksponering for annonsen enten på grunn av tidligere infeksjoner med annonsen eller etter den første leveransen i systemisk programmer heve en ytterligere hindring for effektiv bruk av annonsen vektorer, og de bør unngikk i effektiv systemisk levering.
Til slutt, den sterke hepatotropism av enkelte annonsetyper (inkludert Ad5) alvorlig hindrer programmet annonse i systemiske terapi. Denne tropism som fører til hepatocyte signaltransduksjon er høy affinitet av annonsen virion blod koagulasjon faktor X (FX), formidlet av samspillet av FX med det annonse hexon protein20,21,22. FX broer virion til heparin sulfate glykaner (HSPGs) på overflaten av hepatocytter20,23,24,25. En avgjørende faktor for denne samhandlingen synes å være bestemt omfanget av N – og O-sulfation av HSPGs i leveren24, som er forskjellig fra HSPGs på andre celletyper. I tillegg til denne FX-mediert veien tyder nyere studier ytterligere veier ikke identifisert som resulterer i annonsen signaltransduksjon hepatocytter26,27,28.
Nylig har det vist at FX ikke er bare involvert i hepatocyte signaltransduksjon annonse, men også av bindingen, virion skjold viruset partikkel mot nøytralisering av komplement systemet26. Reduksjon av hepatocyte signaltransduksjon ved å hindre FX bindende, derfor ville skape uønskede bivirkning av økende annonse nøytralisering via det medfødte immunsystemet.
En dyp kunnskap om komplekse interaksjoner mellom vektorer og vert organismer er derfor nødvendig å utvikle mer effektive vektorer for systemisk programmer som omgå hindringene pålagt av verten organisme.
En strategi som har vært opprinnelig brukt i terapeutisk proteiner er tilpasset annonse vektorer til minst delvis overvunnet ovenfor beskrevet barrierer. Antigenicity og immunogenisitet terapeutiske protein forbindelser kan reduseres ved å koble til polyetylenglykol (PEG)29,30. Derfor kovalente koblingen av polymerer som PEG eller poly [N-(2-hydroksypropylcellulose) methacrylamid] (pHPMA) til kapsid overflaten skjold vektor fra uønskede vektor-vert interaksjoner. Vanligvis mål polymer kopling ε-Amin grupper fra lysin siden rester som er tilfeldig fordelt på kapsid overflaten. Vector partikler i løsningen er, på grunn av hydrofile natur de vedlagte polymerer, omgitt av en stabil vann skall som reduserer risikoen for immun celle anerkjennelse eller enzymatisk degradering. Videre ble pegylert annonse vektorer vist å unngå nøytralisering av anti-hexon antistoffer i vitro og pre vaksineres mus i vivo31. I motsetning til genetisk kapsid modifikasjoner utføres kjemiske koblingen av polymerer etter produksjon og rensing, tillater ikke bruk av konvensjonelle produsent celler og produksjon av høy titer vektor aksjer, men også samtidig modifisering av aminosyrer på kapsid overflaten. Men skjer Amin rettet skjerming tilfeldig gjennom hele kapsid overflaten, noe som resulterer i høy heterogeneities og ikke tillater endring av bestemte capsomers. Videre, de store polymer moieties kreves for gunstige effekter svekke virus bioactivity32.
Å overvinne disse begrensningene, Kreppel et al. 33 innført en geneti-kjemiske konsept for vektor re- og de målretting. Cysteinene introdusert genetisk i virus kapsid løsemiddel-eksponerte posisjoner som fiber HI-loop33, protein IX34og hexon35,36. Selv om ikke naturlig forekommende, cystein rentebærende annonse vektorer kan produseres på høy titers i normal produsent celler. Viktigere, gir innsetting av cysteinene i bestemte capsomers og i ulike stillinger innenfor en enkelt capsomer svært spesifikke endringer av thiol gruppe-reaktive moieties. Denne geneti-kjemiske har vist seg å overvinne mange hindringer i annonsen vektor design. Kombinasjonen av Amin-baserte PEGylation for detargeting og thiol-baserte koblingen av transferrin til fiber knotten HI-loop har vist seg å lykkes bør du omkonfigurere modifisert annonse vektorer til bil-mangelfull celler33. Siden hexon er involvert i mest uønsket interaksjon (nøytralisere antistoffer, blod koagulasjon faktor FX), ble thiol-baserte endring strategier også brukt til hexon. Koble små PEG-moieties til HVR5 av hexon hindret annonse vektor partikler for å transduce SKOV-3 celler i nærvær av FX, mens store PEG moieties økt hepatocyte signaltransduksjon14,35. Annonse vektor partikler bærer mutasjoner i fiber knotten hemme bil bindende og HVR7 hemme binding av FX (og peiling satt cysteinene i HVR1 for posisjon-spesifikk PEGylation) ble vist å unngå antistoff – og komplement-mediert nøytralisering, og åtseldyr reseptor-mediert opptak uten tap infectivity. Interessant, til tross for mangel på naturlige FX skjoldet forbedret PEGylation igjen signaltransduksjon hepatocytes som en funksjon av PEG størrelse36. Imidlertid ble det vist at kovalente skjerming har en innvirkning på intracellulær menneskehandel prosesser. Prill et al. sammenlignet irreversibel versus bioresponsive skjold basert på pHPMA og viste at verken modus av skjerming eller co polymer hatt innvirkning på celleoppføring men påvirket partikkel handel til kjernen. Ansette en bioresponsive skjold med positivt ladede pHPMA co polymerer tillatt for partikkel handel til kjernen, opprettholde høy signaltransduksjon effektiviteten av annonsen vektorer i vitro og vivo37.
Oppsummert viser disse data at selv under forutsetning av at alle vektor-vert-interaksjoner ble kjent og vurdert, overdreven kapsid overflaten endringer er nødvendig å overvinne hindrene forbundet med systemisk vektor levering.
Her gir vi en protokoll for å utføre områdespesifikke kjemiske modifikasjoner av adenovirus vector capsids skjerme og/eller retargeting adenovirus vektor partikler og adenovirus-baserte kan virus. Konseptet med denne teknologien er skissert i figur 1. Den lar skjerming av visse kapsid regioner fra uønsket interaksjon av kovalente vedlegg av syntetiske polymerer. Samtidig gir det også en måte å knytte ligander og kombinere skjerming og målretting. Bruke enkel kjemi, vil forskere kunne endre covalently adenovirus vektor overflaten med en rekke molekyler inkludert peptider/proteiner, karbohydrater, lipider, og andre små molekyler. Videre gir protokollen et generelt begrep for kjemisk endring av biologisk aktive virus-avledet vektorer under vedlikehold av deres biologiske integritet og aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effektiviteten som de genetisk introdusert cysteinene kan bli kjemisk endret er vanligvis 80-99%, og enkelte variabler påvirke dette effektivitet. Først er det viktig at de genetisk introdusert cysteinene ikke gjennomgår tidlig oksidering. Samtidig er godt beskyttet i å redusere miljøet produsent cellene, er det obligatorisk å gi et ikke-oksidativ miljø etter frigir vektor partikler fra produsent cellene og under kjemisk endring. Dette reduserer reagenser kan brukes i konsentrasjoner fra 0,1-10 mM, og det er nødv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
Riferimenti
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, 570-573 (1953).
- van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
- Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
- Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
- Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
- Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
- Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
- Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
- Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
- Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
- Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
- Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
- Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
- Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
- Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
- Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
- Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
- Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
- Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
- Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
- Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
- Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
- Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
- O’Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
- Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
- Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
- Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
- Prill, J. -. M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
- Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. , 377-388 (2017).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).
