Presenteren we een methode voor de beoordeling van de ruimtelijke omvang van verwonding/dood van de cel op het gewrichtsoppervlak van intact lymfkliertest gewrichten na toepassing van gecontroleerde mechanische belastingen of effecten. Deze methode kunt u nagaan hoe artrose, genetische factoren en/of verschillende laden regimes van invloed zijn op de kwetsbaarheid van in situ chondrocyten worden gebruikt.
Homeostase van articulair kraakbeen, is afhankelijk van de levensvatbaarheid van resident cellen (chondrocyten). Helaas, mechanische trauma kan veroorzaken wijdverspreide chondrocyten dood, mogelijk leiden tot onomkeerbare uitsplitsing van het gewricht en het begin van artrose. Onderhoud van chondrocyten levensvatbaarheid is bovendien belangrijk in osteochondrale graft procedures voor optimale chirurgische resultaten. Presenteren we een methode voor de beoordeling van de ruimtelijke omvang van verwonding/dood van de cel op het gewrichtsoppervlak van intact lymfkliertest synoviale gewrichten na toepassing van gecontroleerde mechanische belastingen of effecten. Deze methode kan worden gebruikt in vergelijkende studies te onderzoeken van de effecten van verschillende mechanische belasting regimes, verschillende milieuomstandigheden of genetische manipulaties, evenals verschillende stadia van degeneratie van het kraakbeen op korte – en/of op lange termijn kwetsbaarheid van in situ articulaire chondrocyten. Het doel van het protocol geïntroduceerd in het manuscript is te beoordelen van de ruimtelijke omvang van verwonding/dood van de cel op het gewrichtsoppervlak van lymfkliertest synoviale gewrichten. Nog belangrijker is, is deze methode kan testen op volledig intact kraakbeen zonder afbreuk te doen aan de inheemse randvoorwaarden. Bovendien zorgt het voor visualisatie in real time van vitaal gebeitst articulaire chondrocyten en één beeld-gebaseerde analyse van cel letsel veroorzaakt door toepassing van gecontroleerde statische en effect laden regimes. Onze representatieve resultaten tonen aan dat in gezond kraakbeen explantaten, de ruimtelijke omvang van cel schade gevoelig belasting omvang en het effect intensiteit hangt. Onze methode kan gemakkelijk aangepast worden aan onderzoeken van de effecten van verschillende mechanische belasting regimes, verschillende milieuomstandigheden of verschillende genetische manipulaties op de mechanische kwetsbaarheid van in situ articulaire chondrocyten.
Articulair kraakbeen (AC) is een dragende weefsel dat behandelt en beschermt botten in synoviale gewrichten, verstrekken van vlotte gezamenlijke articulatie. Weefsel homeostase is afhankelijk van de levensvatbaarheid van de chondrocyten, de enige celtype die woonachtig zijn in AC. Echter kan Gasbedwelming met behulp van kraakbeen extreme krachten als gevolg van trauma (bijv, falls, voertuig ongeval of sport letsel) of als gevolg van post-traumatische gezamenlijke instabiliteit veroorzaken chondrocyten dood, wat leidt tot onomkeerbare uitsplitsing van het gewricht (artrose) 1. bovendien in osteochondrale enten procedures die gericht zijn op plaatselijke gebreken in beschadigd kraakbeen, graft invoeging-geassocieerde mechanische trauma vermindert chondrocyten levensvatbaarheid en heeft nadelige gevolgen voor chirurgische resultaten2.
Kraakbeen explant modellen worden gebruikt bij het bestuderen van de gevoeligheid van de articulaire chondrocyten voor mechanisch-veroorzaakte celdood. Deze modellen gebruiken meestal explantaten van grote dieren te bestuderen van de gevolgen van het laden van de voorwaarden, de omgevingsomstandigheden en andere factoren op cel beveiligingslek3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Echter, als gevolg van de grote omvang van de inheemse gewrichten, deze modellen in het algemeen vereisen verwijdering van een stekker uit het gewrichtsoppervlak van een intact gewricht, waardoor afbreuk te doen aan inheemse randvoorwaarden. Bovendien, ze over het algemeen vergt toepassing van grote mechanische belastingen voor het opwekken van cel letsel. U kunt ook bieden lymfkliertest kraakbeen explant modellen verschillende voordelen ten opzichte van grotere dierlijke modellen bij het bestuderen van de mechanische kwetsbaarheid van in situ chondrocyten. Met name als gevolg van hun kleinere afmetingen vergemakkelijken deze modellen testen van volledig intact articulair kraakbeen zonder te veranderen van inheemse weefsel integriteit. Bovendien, laden van lymfkliertest kraakbeen vindt plaats via kleine contact gebieden zodanig dat chondrocyten dood/letsel kan worden opgewekt met kleine lastdragers (< 1 N). Tot slot, het genoom van de muis wordt gemakkelijk gemanipuleerd, waardoor testen van hoe specifieke genen invloed op de gevoeligheid van in situ chondrocyten voor mechanische schade.
Het algemene doel van de methode geïntroduceerd in dit manuscript is te kwantificeren en visualiseren-in real-tijd-de ruimtelijke omvang van in situ cel dood/letsel als gevolg van de toegepaste mechanische belastingen op volledig intact muis kraakbeen-op beendermeel explants in vitro. Deze methode vereist zorgvuldige dissectie van muis synoviale gewrichten zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid van de chondrocyten, gevolgd door mechanische beproeving van vitaal gebeitst explantaten met behulp van een Microscoop gemonteerde apparaat vergelijkbaar met een test platform dat we onlangs ontwikkeld te kwantificeren lymfkliertest kraakbeen mechanische eigenschappen16. Tijdens het testen van de mechanische, is een groot deel van de (intacte) gewrichtsoppervlak van het bot ontleed zichtbaar op een opname van één fluorescentie, waardoor snelle analyse van de levensvatbaarheid van de cellen, nadat een belasting is toegepast. Een soortgelijke analyse van de levensvatbaarheid van de cellen van de oppervlakte in lymfkliertest kraakbeen explantaten is uitgevoerd eerder, maar zonder gelijktijdige toepassing van belasting17. Potentiële toepassingen van onze methode omvatten vergelijkende studies om te onderzoeken van de kwetsbaarheid van de articulaire chondrocyten aan verschillende gecontroleerde milieu- en mechanische omstandigheden, alsmede screening van behandelingen gericht op het verminderen van de gevoeligheid van chondrocyten aan mechanische belasting.
De hierboven beschreven methoden werden met succes ingezet om te visualiseren van levensvatbare en gewond/dode in situ articulaire chondrocyten van muis gewrichten nadat voorgeschreven mechanische belastingen of effecten. In het bijzonder, konden we voor het analyseren van de mechanische kwetsbaarheid van chondrocyten binnen volledig intact articulair kraakbeen uit twee verschillende synoviale gewrichten: het kniegewricht (distale dijbeen) en schouder (humeri). Onze representatieve resultaten tonen aan dat de ru…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank Dr. Richard Waugh en Luis Delgadillo voor het royale gebruik van hun pH-meter en osmometer. Bovendien, bedank de auteurs Andrea Lee bij te dragen tot de initiële ontwikkeling van de mechanische testsysteem. Deze studie werd gefinancierd door de NIH P30 AR069655.
Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |