Dette papir rapporter protokol for en hurtig identifikation assay for Bemisia tabaci baseret på løkke-medieret isotermisk forstærkning (lampe) teknologi. Protokollen kræver minimal laboratorium uddannelse og kan derfor gennemføres på stedet på indgangssteder for anlægget import som søhavne og lufthavne.
Whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) er en invasiv skadedyr af stor betydning, der berører produktionen af grøntsager og prydplanter afgrøder i mange lande rundt om i verden. Svær udbyttetab er forårsaget af direkte fodring, og endnu vigtigere, også ved fremsendelse af mere end 100 skadelige plante patogene vira. Som for andre invasive skadedyr letter øget international handel spredningen af B. tabaci til områder uden for dens naturlige spredningsområde. Inspektioner af anlæg importere produkter ved indgangssteder såsom søhavne og lufthavne er, derfor, set som en vigtig forebyggende foranstaltning. Denne sidste linje i forsvaret mod skadedyr invasioner er imidlertid kun effektiv, hvis hurtige identifikationsmetoder til mistænkelige insekt prøver er let tilgængelige. Fordi de morfologiske differentiering mellem regulerede B. tabaci og nære slægtninge uden karantæne status er vanskeligt for ikke-taksonomer, en hurtig molekylære identifikation analysen baseret på løkke-medieret isotermisk forstærkning ( LAMPE) teknologi er blevet udviklet. Denne publikation rapporter detaljerede protokollen af roman assay beskriver hurtige DNA-ekstraktion, opsætning af lampe reaktion og fortolkning af dens læse-out, som giver mulighed for at identificere B. tabaci prøver inden for en time. I forhold til eksisterende protokoller til påvisning af specifikke B. tabaci biotypes, udviklede metoden henvender sig til hele B. tabaci arter kompleks i én analyse. Desuden er assayet designet til at blive anvendt på stedet af plante sundhed inspektører med minimal laboratorium uddannelse direkte ved indgangssteder. Grundig validering udføres i henhold til laboratorieundersøgelser og stedets betingelser viser, at de rapporterede lampe assay er en hurtig og pålidelig identifikation værktøj, forbedring af forvaltningen af B. tabaci.
Whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) er en invasiv insekt skadedyr, der påvirker udbyttet af mange økonomisk vigtige afgrøder herunder prydplanter, grønt, bælgplanter og bomuld1,2. Ved siden af skader gennem direkte phloem-fodring, skader arternes homopteran planter indirekte ved udskillelse af store mængder af honningdug på overflader af blade og frugter samt ved fremsendelse af talrige plante patogene vira1 , 3 , 4. seneste genetiske undersøgelser sammenligne DNA-sekvenser af mitokondrie gen cytokrom c oxidase 1 (COI) viste, at B. tabaci en art komplekse mindst 34 morphocryptic arter3,4. To meget invasive og skadelige medlemmer inden for dette komplekse, biotype B stammer fra Mellemøsten og asiatiske mindre regionen, samt biotype Q stammer fra Middelhavsområdet, har været spredt globalt gennem international handel aktiviteter med vegetabilske produkter, især ved transport af prydplanter1,5,6. På grund af sin status som verdensomspændende pest, den internationale Union for bevarelse af naturen og naturressourcerne (IUCN) opført B. tabaci som et af “verdens 100 værste invasive fremmede arter” og medlemmer af de komplekse arter er reguleret organismer af mange lande1,3,4.
I den Europæiske Union (EU), er B. tabaci anført i den plante sundhed direktiv 2000/29/EF bilag 1AI som en karantæne organisme hvis indførsel fra lande uden for EU og dens udbredelse inden for EU er forbudt4. En væsentlig forebyggende foranstaltning mod spredning af karantæne organismer er inspektion af plante forsendelser ved indgangssteder (POEs) såsom lufthavne og søhavne7,8. I tilfældet findes en karantæne organisme, nationale Plant Protection organisation (NPPO) i afgift tager handling af enten afvise eller behandling (herunder tilintetgørelse) af angrebne leverance9. Officerer inspicerer importen ofte har dog ikke den taksonomiske ekspertise til præcist at identificere det omfattende udvalg af skadedyr arter tilknyttet verdenshandelen9. Især identifikation af umodne livsstadier (fx æg og larver) uden særskilt morfologiske nøgler er stort set umuligt for ikke-taksonomer8,9,10. Hen til muliggøre gennemførelsen af karantæneforanstaltninger med minimal forsinkelse, er der derfor behov for alternative, hurtig on-site identifikation assays9.
En kandidat metode er den loop-medieret isotermisk DNA amplifikation (lampe) teknologi, der har for nylig vist sig at være en egnet teknologi til identifikation af anlægget patogener11,12,13. LAMPEN er meget specifikke, fordi metoden anvender mindst to primer par anerkender seks forskellige DNA target sekvenser14. På grund af DNA strand forskydning aktiviteten af Bst DNA polymerase udføres lampe reaktioner under isotermiske forhold14. Derfor, i modsætning til konventionelle Polymerasekædereaktionen (PCR)-baseret assays der er ikke behov for en termisk cycler13,14. En anden fordel i forhold til PCR-baserede analyser er dens modstandsdygtighed mod potentielle hæmmere i DNA-ekstrakt, omgå behovet for et DNA oprensning trin13. På grund af protokollens hastighed og enkelhed, kan LAMPEN selv udføres on-site betingelser ved hjælp af en bærbar, batteri drevet real-time opdagelse enhed8,15.
En lampe analyse blev designet som reaktion på kravet om en hurtig on-site identifikationsmetode for B. tabaci8. Det overordnede formål var at udvikle en protokol, der kan udføres af plante sundhed inspektører med begrænset laboratorium uddannelse. Et stærkt fokus var, derfor indstillet på at optimere hastighed og enkelhed af protokollen. Mens eksisterende diagnostiske tests er generelt blevet udviklet til identifikation af en eller flere biotypes af B. tabaci, Roman lampe analysen dækker hele B. tabaci arter komplekse8,16,17 ,18. Udtalt genetiske inden for-systematisk mangfoldighed af komplekset blev løst ved hjælp af kombinationer af forskellige primer sæt og anvendelsen af degenereret primere8. Roman B. tabaci lampe assay er designet på en sådan måde, at primere målrette et fragment i 3′-slutningen af mitokondrie COI gen8. Dette gen præsenterer et passende mål for animalske diagnostiske undersøgelser, fordi det havne regioner bevares nok til at sikre diagnostiske følsomhed for en bestemt art, under diskriminerer nok mellem nært beslægtede organismer19, 20. Desuden COI gen bruges ofte som en genetiske markør i befolkningen genetiske undersøgelser samt en signatur sekvens i DNA barcoding analyser, resulterer i adskillige DNA sekvens poster i open source-databaser såsom GenBank og fed21 ,22. Ved siden af de offentligt tilgængelige oplysninger om Oprindelseslande sekvenser fra B. tabaci, COI sekvenser fra nært beslægtede arter (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp. [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciaeog Trialeurodes spp. [N = 4]) blev inkluderet i primer design af denne undersøgelse og bruges til at vurdere diagnostiske sensitivitet og specificitet i siliciummangan8 .
På grund af nøjagtigheden af metoden, dens hastighed (< 1 h) og enkelheden i protokollen, analysen har vist at være velegnet til on-site ansøgning når implementeret som en del af proceduren for import på en schweizisk POE8.
Evnen til at identificere potentielt skadelige organismer uden tidsforsinkelse repræsenterer et kritisk aspekt for forvaltningen af skadedyr arter9,10,26. Udover at være hurtig, for import planteprodukter, bør en ideel skadedyr identifikationsmetode være enkle at udføre onsite på POEs8,26. Dette papir rapporterer en roman lampe assay til hurtig identifikation af B. tabaci, en karantæne insekt organisme ofte opsnappet ved EU ‘s grænser (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt-protokollen _annual-rapport _2016.pdf).
Rationalet bag udviklingen af den diagnostiske test var at designe en let at følge protokollen, som kan udføres under den plante procedure for import af plante sundhed inspektører med minimal laboratorium uddannelse. For at gøre onsite test som hurtige og enkle som muligt, er protokollen opdelt i to dele, udarbejdelse af en klar-til-brug kit og selve udførelsen af LAMPEN assay. Den første del kan foretages i et eksternt laboratorium, således at plante sundhed inspektør kan udføre DNA-ekstraktion og lampe assay on-site med kun én pipettering trin.
Selv om kun ét trin, pipettering små mængder af væske kan være udfordrende for brugere med ringe eller ingen laboratorium erfaring. For at løse dette problem, tilføjes et farvestof (cresol rød) ekstraktionsopløsningen således at operatøren kan visuelt bekræfte den lille mængde (dvs. 2,5 µL) af DNA er korrekt overført til den respektive tube. En anden vigtig forenkling af protokollen er programmet validering som det letter en pålidelig fortolkning af lampe udlæsning (supplerende fil 1).
Roman B. tabaci lampe assay er blevet valideret laboratorieundersøgelser og stedets betingelser ved at teste insekt prøver opfanges under regelmæssig kontrol-importen af Schweiz8. I alt blev 80 enheder fra tre kontinenter, Afrika, Eurasien og Nordamerika, analyseret af lampe. Af de 80 enheder var kun tre (3,8%) fejlagtigt identificeret (false-negativer)8. Når du analyserer primer target DNA-sekvenser af falsk negative prøver, konstateredes det, at de var nye B. tabaci haplotypes, der ikke hidtil har været beskrevet8. Baseret på disse resultater, har B. tabaci lampe primer sæt været modificeret og med succes re validerede8.
En stor begrænsning af enhver DNA amplifikation-baseret metode herunder lampe er, at de kun betegner foruddefinerede mål DNA sekvenser8,27. En omfattende viden om den genetiske variation fundet i primer target sekvens er derfor afgørende at sikre diagnostiske nøjagtighed8,27. Sådanne oplysninger er dog ofte meget begrænset, især i forbindelse med nyopstået skadedyr arter8. Selvom sjælden, er falsk negative resultater skyldes mutationer i target sekvens forventede8. I forbindelse med den nuværende B. tabaci lampe assay er en løsning på dette problem en kombination med en DNA barcoding-baseret teknologi, en strategi, der er realiseret i forbindelse med gennemførelsen af denne diagnostiske test på POE Zürich lufthavn8. Her, alle lampe-negative resultater var re-analyseres af DNA barcoding i et eksternt laboratorium8. I tilfælde af en roman skadedyrsbekæmpelse haplotype endnu ikke beskrevet er stødt på, kan lampe primere ændres ved hjælp af DNA-sekvens genereret i stregkodesystem proces8. Dermed, der det deraf følgende tab af hastighed i tilfælde af et negativt resultat af lampe kompenseres for den maksimale diagnostisk nøjagtighed sikres i denne to-trins proces8.
De nuværende lampe analysen på en POE opstartsomkostningerne er cirka USD 25.000. Med det stigende antal lampe test udviklet til plante skadedyr (fx Erwinia amylovora, Flavescence dorée og Guignardia citricarpa), sådan en engangsinvestering vises begrundede13,15, 28. imidlertid protokollen kunne potentielt blive ændret for at reducere disse omkostninger endnu mere. For eksempel, for DNA-ekstraktion kunne trin ved 95 ° C thermo mixer brugt her blive erstattet af en billigere vandbad, eller ved at udføre dette trin direkte i realtid lampe enhed. Derudover blanding trinene på vortex kunne sandsynligvis blive erstattet af manuelt svippede rør, og i DNA overførsel skridt pipette kan erstattes af sterile podning sløjfer.
Fremtidige forbedringer til en hurtig identifikation af B. tabaci og skadedyr arter kunne i almindelighed være en gennemførelse af en on-site sekventering tilgang, der gør det muligt for at udføre DNA barcoding analyser på POEs. En lovende kandidat system for sådan en gennemførelse er nanopore sekventering teknologi. Faktisk, teknologien har for nylig været med succes gennemført i et on-site DNA barcoding forsøg til vurdering af biodiversiteten i en regnskov8,29,30. En on-site DNA barcoding identifikationssystem kan helt erstatte behovet for udvikling af målrettede diagnostiske test og deres validering. Det giver også mulighed for, at indsamle yderligere oplysninger om pest karakteristika såsom pesticider resistens gener8. Ikke desto mindre, indtil romanen sekventering teknologier gennemføres rutinemæssigt, B. tabaci lampe analysen repræsenterer en hurtig (< 1 h) og nøjagtig identifikationsmetode.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun og Sven Moeller taknemmelig for at deltage i validering af B. tabaci lampe assay.
B. tabaci LAMP primer mix | OptiGene Ltd. | on request | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
Centrifuge MiniSpin | Eppendorf AG | 5452000010 | For several centrifugation steps |
Cresol red (red dye) | Sigma-Aldrich Corp. | 114472 | Component of DNA extraction solution |
Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf AG | 5382000015 | For DNA extraction |
Genie II (on-site LAMP analysis device) | OptiGene Ltd. | Genie® II | For LAMP analysis |
Genie Strips (8-tube LAMP strips) | OptiGene Ltd. | OP-0008-50 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
HotStarTaq Master Mix | Qiagen AG | 203443 | For generation of positive amplification control |
Labcycler (Thermocycler) | SensoQuest GmbH, distributed by Witec AG |
011-103 | For DNA extraction |
GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix | OptiGene Ltd. | ISO-001LNL | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
Mini centrifuge Labnet Prism | Labnet International Inc. | C1801 | For several centrifugation steps |
NucleoFast 96 PCR | Marcherey-Nagel GmbH | 743500.4 | For clean-up of positive amplification control |
Potassium hydroxide solution | Sigma-Aldrich Corp. | 319376 | Component of DNA extraction solution |
Qbit Fluorometer 3 | Thermo Fisher Scientific Corp. | Q33226 | For measuring DNA conentration of positive control |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | For clean-up of positive amplification control |
Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 121.023 | For DNA extraction |
Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 120.094 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
Wood Toothpicks | VWR International LLC | 470226-594 | For DNA extraction |
Vortex-Genie 2 (Vortex) | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | For several mixing steps |