ניתוח הטמפורלי של רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של חלבון 1 וירוס הרפס סימפלקס מאת Immunofluorescent קונפוקלית
Summary
ICP0 עובר טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. מנגנון מולקולרי של אירוע זה אינו ידוע. כאן נתאר את השימוש מיקרוסקופ קונפוקלי ככלי לכמת ICP0 בתנועת זיהום HSV-1, אשר מניחה את היסודות לניתוח באופן כמותי ICP0 רוברטסונית במחקרים מכניסטית בעתיד.
Abstract
התא הנגוע חלבון 0 (ICP0) של נגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1) הוא חלבון מוקדם מיידי המכיל ליגאז אוביקוויטין טבעת-סוג E3. הוא אחראי על השפלה proteasomal ושל גורמים מגבילים מארח את הפעלת גנים ויראליים עוקבות. ICP0 מכיל רצף הקנוני לוקליזציה גרעינית (שקל). הוא נכנס לגרעין מיד לאחר הסינתזה דה נובו , ביצוע תפקידיה הגנה אנטי-מארח בעיקר בגרעין. עם זאת, בהמשך זיהום, ICP0 נמצא אך ורק בציטופלסמה, רומז המופע של התקה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. יש להניח ICP0 רוברטסונית מאפשר ICP0 לווסת את תפקידיה לפי מיקומים subcellular שלה-שלבים שונים זיהום. על מנת ניסחו את תפקוד ביולוגי ואת מנגנון רגולטורי של טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic ICP0, לשנות את שיטת מיקרוסקופ immunofluorescent לעקוב אחר ICP0 סחר במהלך זיהום HSV-1. פרוטוקול זה כרוך immunofluorescent מכתים, מיקרוסקופ קונפוקלי הדמיה, גרעיני לעומת התפלגות cytoplasmic וניתוח. המטרה של פרוטוקול זה היא להתאים את מצב יציב קונאפוקלית מתמונות שצולמו מסלול הזמן לתוך תיעוד כמותית של התנועה ICP0 הזיהום lytic. אנו מציעים כי בשיטה זו ניתן להכליל לנתח באופן כמותי את גרעיני לעומת cytoplasmic לוקליזציה של חלבונים ויראלי או סלולר אחרים מבלי לערב את טכנולוגיית הדמיה בשידור חי.
Introduction
נגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1) גורם מגוון רחב של מתון למחלות מהרפס קשות, כולל הרפס labialis, הרפס, keratitis סטרומה של אנצפליטיס. לאחר נגוע, הווירוס יוצר דלקת סמויה לכל החיים בנוירונים הגרעינים. לעיתים, הווירוס ניתן להפעיל מחדש על ידי מסיבות שונות כגון חום, מתח, דיכוי המערכת החיסונית1, שמוביל הרפס חוזרים ונשנים. התא הנגוע חלבון 0 (ICP0) הוא מווסת ויראלי מפתח קריטי עבור זיהום HSV-1 lytic והן סמויה. זה transactivates וירוס במורד הגנים באמצעות עצירת מארח הגנות אנטי ויראליים מהותי/מולדת2,3. ICP0 יש פעילות ליגאז אוביקוויטין E3, אשר מטרות מספר גורמים תא פרוטאוזום תלוית השפלה3. זה גם אינטראקציה עם מסלולים שונים תא להסדיר את פעילותם ובעקבות כך להסטת מארח הגבלות אנטי-ויראלי3. ICP0 ידוע כדי לאתר תאים subcellular שונים כמו הזיהום ממשיך3,4,5. החלבון יש אות לוקליזציה גרעיני ליזין/ארגינין-עשיר (שקל) ממוקם ב שאריות 500 כדי 5066. על סינתזת דה נובו -זיהום HSV-1 מוקדם, ICP0 מיובא באופן מיידי הגרעין. הוא קודם זוהה-דינאמי גרעיני מבנה הנקרא תחום גרעיני 10 (ND10)7. אוביקוויטין E3 ליגאז פעילות ICP0 מפעיל את ההשפלה של ND10 מארגן חלבונים, חלבונים (PML) לוקמיה פרומיאלוציטית חלבון מנומר 100 kDa (Sp100)8,9,10. לאחר ההפסד של חלבונים המארגן, ND10 גרעיני גופות מפוזרים, ICP0 עובר פיזור כדי למלא את גרעין כל4,11.
מעניין, לאחר תחילתה של שכפול ה-DNA ויראלי, ICP0 נעלמת מהגרעין. הוא אך ורק נמצא בציטופלסמה, רומז המופע של התקה גרעינית-כדי-cytoplasmic בשלהי HSV-1 זיהום4,12. הדרישה של שכפול ה-DNA מרמז על מעורבות אפשרית protein(s) ויראלי מאוחר בקידום רוברטסונית cytoplasmic של HSV-1 ICP04,12. מסתבר ICP0 סחר בין תאים שונים במהלך זיהום מסמיכה ICP0 כדי לווסת את האינטראקציות שלה כדי מסלולים סלולריים שונים בצורה מרחבית-טמפורלית, לכן הקואורדינטות שלה פונקציות מרובות משובח לכוון את האיזון בין lytic, החבויים HSV-1 זיהום13. כדי להבין טוב יותר את ICP0 multifunctionality ואת התיאום של תחומים פונקציונליים ICP0 לאורך כל הזיהום lytic, ניתחנו בקפידה הבסיס המולקולרי של טרנסלוקציה ICP0 דינמי12. לערוך מחקרים מכניסטית שדווחה בעבר12, אנחנו החלת שיטת צביעת immunofluorescent להמחיש לוקליזציה subcellular ICP0 על מצב זיהום שונים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. גם פיתחנו פרוטוקול כמותיים כדי לנתח גרעיני לעומת cytoplasmic חלוקת ICP0 שימוש בתוכנה קונפוקלי. אוכלוסיית תאים נגועים HSV-1 היה ייערכו לאורך כל שלבי הזיהום, המגמות של התנועה ICP0 נותחו, תחת טיפולים ביוכימיים שונים12. כאן נתאר פרוטוקול מפורט את המסמכים ICP0 רוברטסונית ב זיהום HSV-1. אנו מציעים כי שיטה זו יכולה להיות מאומץ כשיטה כללית ללמוד גרעיני לעומת cytoplasmic רוברטסונית אחרים חלבונים ויראלי או סלולרי, אשר יכול לשמש אלטרנטיבה הדמיה בשידור חי טכניקת דימות בשידור חי הוא לא מתאים בשל בעיות כגון תיוג שיטה, עוצמת אות או חלבון שפע.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה שימש ללמוד רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של HSV-1 ICP0. ICP0 עובר סחר subcellular במהלך זיהום HSV-1 (איור 1). סביר להניח, ICP0 מקיים אינטראקציה עם מסלולים שונים תא כדי לבצע פונקציות שונות במקומות שונים. פעולה זו מאפשרת ICP0 לחידוד שלה פונקציות מרובות משיכת עם הפונדקאי. האנושי<sup class="…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים תמיכה כספית מ גרנט NIH (RO1AI118992) מוענק גו Haidong. אנו מודים המתקן הדמיה, מיקרוסקופיה הליבה Cytometry משאבים (MICR) באוניברסיטת וויין לקבלת תמיכה טכנית.
Materials
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
Riferimenti
- Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. Herpes simplex viruses. Fields’ Virology. , 1823-1897 (2013).
- Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
- Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
- Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
- Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
- Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
- Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
- Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
- Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
- Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
- Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
- Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?. Future Virology. 13 (6), (2018).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
- Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378 (2016).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
