Timelige analyse av kjernefysisk-til-cytoplasmatiske translokasjon av et Herpes Simplex Virus 1 Protein av Immunofluorescent AC Confocal mikroskopi
Summary
ICP0 gjennomgår kjernefysiske-til-cytoplasmatiske translokasjon under HSV-1-infeksjon. Molekylær mekanismen av denne hendelsen er ikke kjent. Her beskriver vi bruk av AC confocal mikroskop som et verktøy for å kvantifisere ICP0 bevegelse i HSV-1-infeksjon, som legger grunnlaget for kvantitativt analysere ICP0 translokasjon i fremtidige mekanistisk studier.
Abstract
Infiserte cellen protein 0 (ICP0) av herpes simplex virus 1 (HSV-1) er en umiddelbar tidlig protein inneholder en RING-type E3 ubiquitin ligase. Det er ansvarlig for proteasomal nedbrytning av vert faktorer for restriktiv og påfølgende viral genet aktivering. ICP0 inneholder en kanoniske kjernefysiske lokalisering sekvens (NLS). Det går inn i kjernen umiddelbart etter de novo syntese og utfører sine anti-vert forsvar funksjoner i kjernen. Men senere i infeksjon, er ICP0 funnet utelukkende i cytoplasma, tyder forekomsten av en kjernefysisk-til-cytoplasmatiske translokasjon under HSV-1-infeksjon. Antagelig kan ICP0 translokasjon ICP0 til å modulere funksjonene i henhold til subcellular steder i ulike infeksjon faser. For å avgrense den biologiske funksjonen og regulatoriske mekanisme ICP0 kjernefysiske-til-cytoplasmatiske translokasjon, endret vi en immunofluorescent mikroskopi metode for å overvåke ICP0 smugling under HSV-1-infeksjon. Denne protokollen innebærer immunofluorescent flekker, AC confocal mikroskop tenkelig og kjernefysiske vs cytoplasmatiske distribusjon analyse. Målet med denne protokollen er å tilpasse steady state AC confocal bilder tatt i en tid kurs i en kvantitativ dokumentasjon ICP0 bevegelse gjennom lytisk infeksjonen. Vi foreslår at denne metoden kan generaliseres kvantitativt analysere kjernefysiske vs cytoplasmatiske lokalisering av andre virus eller cellular proteiner uten å involvere live bildeteknologi.
Introduction
Herpes simplex virus 1 (HSV-1) fører en rekke av mild til alvorlig postherpetisk sykdommer som herpes labialis, genital herpes, stromal keratitt og encefalitt. En gang infisert, oppretter viruset en livslang latente infeksjon i Ganglion neurons. Noen ganger kan viruset reaktiveres av forskjellige grunner som feber, stress og uimottakelig undertrykkelse1, fører til tilbakevendende herpes infeksjon. Infiserte cellen protein 0 (ICP0) er en viktig viral regulator avgjørende for både lytisk og latente HSV-1-infeksjon. Det transactivates nedstrøms virus gener via motvirke vert iboende/medfødte antiviral forsvar2,3. ICP0 har en E3 ubiquitin ligase aktivitet, som mål celle faktorer for proteasome-avhengige fornedrelse3. Det også samhandler med ulike celle stier å regulere sine aktiviteter og senere å kompensere vert antiviral restriksjoner3. ICP0 er kjent for å finne på ulike subcellular avdelinger som infeksjonen går3,4,5. Protein har lysin/arginine-rik kjernefysiske lokalisering signal (NLS) på rester 500 til 5066. På de novo syntese på tidlig HSV-1-infeksjon importeres ICP0 umiddelbart til kjernen. Det er først oppdaget på en dynamisk kjernefysiske struktur kalt kjernefysiske domene 10 (ND10)7. E3 ubiquitin ligase aktiviteten til ICP0 utløser nedbrytning av ND10 organizer proteiner, promyelocytic leukemi (PML) protein og flekkete protein 100 kDa (Sp100)8,9,10. Etter tapet av arrangøren proteiner, ND10 kjernefysiske organer er spredt og ICP0 er diffust for å fylle hele kjernen4,11.
Interessant, etter utbruddet av viral DNA-replikasjon forsvinner ICP0 fra kjernen. Den finnes kun i cytoplasma, tyder forekomsten av en kjernefysisk-til-cytoplasmatiske translokasjon sent i HSV-1-infeksjon4,12. Kravet til DNA-replikasjon innebærer mulige involvering av en sen viral protein(s) å tilrettelegge cytoplasmatiske translokasjon av HSV-1 ICP04,12. Tydeligvis ICP0 handel blant forskjellige rom under infeksjon gir ICP0 til å modulere sin interaksjoner ulike mobilnettet stier i en romlig-temporalt mote, og derfor koordinere dets funksjoner til å justere balansen mellom lytisk og latente HSV-1-infeksjon13. For bedre å forstå ICP0 multifunksjonalitet og samordning av ICP0 funksjonelle domener gjennom lytisk infeksjonen, dissekert vi nøye molekylær grunnlag av dynamisk ICP0 translokasjon12. For å gjennomføre den mekanistiske studier tidligere rapportert12, har vi brukt en immunofluorescent flekker metode for å visualisere ICP0 subcellular lokalisering på ulike infeksjonsstatus under AC confocal mikroskop. Vi har også utviklet en kvantitativ protokoll for å analysere kjernefysiske vs cytoplasmatiske distribusjon av ICP0 ved hjelp av AC confocal programvare. Befolkningen av HSV-1-infiserte celler ble ordnet i infeksjon fasene og utviklingen av ICP0 bevegelse ble analysert, under forskjellige biokjemiske behandlinger12. Her beskriver vi detaljerte protokollen at dokumenter ICP0 translokasjon i HSV-1-infeksjon. Vi foreslår at denne metoden kan bli vedtatt som en generell metode å studere kjernefysiske vs cytoplasmatiske translokasjon for andre virus eller cellular proteiner, som kan tjene som et alternativ til live imaging når live bildebehandling teknikken er uanvendelig grunn problemer som merking metoden, signalet intensitet eller protein overflod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen er brukt til å studere kjernefysiske-til-cytoplasmatiske translokasjon av HSV-1 ICP0. ICP0 gjennomgår subcellular smugling under HSV-1-infeksjon (figur 1). Sannsynlig samhandler ICP0 med ulike celle veier å utføre ulike funksjoner på forskjellige steder. Dette kan ICP0 å finjustere dets funksjoner i tug-of-war med menneske vert13. Men er hvor ICP0 koordinerer flere funksjoner i en romlig-temporalt måte ikke godt studert. Med fluorescerende mik…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker økonomisk støtte fra en NIH stipend (RO1AI118992) til Haidong Gu. Vi takker mikroskopi, tenkelig & cytometri ressurser (MICR) Core anlegget ved Wayne State University for kundestøtte.
Materials
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
Riferimenti
- Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. Herpes simplex viruses. Fields’ Virology. , 1823-1897 (2013).
- Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
- Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
- Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
- Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
- Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
- Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
- Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
- Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
- Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
- Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
- Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?. Future Virology. 13 (6), (2018).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
- Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378 (2016).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
