体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究
Summary
ここでは、単球 subpopulation の特定の表面マーカーと共焦点蛍光顕微鏡を用いて in vitro における流動場下における人身売買対策統合のプロトコルを提案する.このプロトコルは、他の特定の表面マーカーを使用して他の白血球のサブタイプをプロファイルとして順次募集手順同様を探索する使用できます。
Abstract
ターゲットの末梢組織に血液中から単球の採用は、組織の損傷、腫瘍の開発、自己免疫疾患の中に炎症性プロセスに不可欠です。これは、基になる影響を受ける組織に接着や内皮下移行 (輪廻) が続いて活性化の内皮細胞の管腔表面に自由な流れからのキャプチャのプロセスによって実現されます。ただし、単球サブポピュレーションの優遇とコンテキスト依存の募集をサポートするメカニズムはまだ完全に理解しました。そこで、同時に可視化し、流動場下における測定に異なる単球サブポピュレーションの採用を可能にする方法を開発しました。タイムラプス顕微鏡を用いたイメージング、に基づいて、このメソッドは明確な付着性と転生の球を区別することができます。ここでは、このメソッドを使用して、同時にプロ血管新生と血管新生の非単球の in vitro の募集カスケードを勉強する方法について述べる。さらに、このメソッドは、最大 3 つの単球集団のリクルートの別の手順を勉強する拡張できます。
Introduction
単球は、損傷した組織、血管新生、癌1,2,3 を含む多くの疾患の病態をクリーンアップする病原体と戦うために不可欠な免疫の貪食コンポーネントを構成します。.単球は骨髄由来細胞が血液中を循環するが、特定の分子機構を末梢組織における炎症のサイトに募集することができます異種の集団から成る。白血球は、単球の募集カスケードは一般に、キャプチャ、圧延、クロール、逮捕、内皮下浸潤 (輪廻)、血管壁 (基底膜と壁画を通じて移行などの異なる手順を関係づけるセル)4。これらの手順は主にセレクチンのリガンドなどの白血球に注目している、糖タンパク質リガンド、ケモカイン、細胞と接合部の接着分子、その受容体など、内皮細胞内腔で炎症誘起分子を含むインテグリンです。血管内皮細胞の接合点 (傍細胞) や内皮細胞体 (transcellular) を通じて人身取引の経路は、内皮バリア5を横断する白血球により使用できます。単球は歴史的に transcellular ルートを通じて霊界に記載されている、しながら、単球はもはや均質の細胞集団を考えられているように、渡り鳥の経路に潜在的な相違が提案されている.多様性単球ごとの相違点と共通点の定義することができます、彼らの独特の血管外漏出に対するカスケード3,6ことが明らかとなりつつあります。したがって、明確に、単球集団間差別するために可視化することが重要だし、募集中のこれらの異なる集団のそれぞれの行動の表現型を処理します。
人間から単球、ブタ、ラット、マウス特定の生得的機能と特定の渡り鳥動作7,8,9形質集団に分割されました。たとえば、ヒトでは、単球が細菌リポ多糖のコレセプター CD14、CD16、Fc γ レセプター III の表面表現に基づく 3 つのサブセットに分けることが。ひと単球のサブポピュレーションを含めるクラシック CD14+CD16–、CD14 を中間+CD16+と非古典的 CD14薄暗いCD16+細胞6,9。古典の CD14+CD16–単球は、主に炎症性であることを示したに対し CD16 のプール+単球は現在 TIE2 発現と血管新生関数10総称して発見されました。一貫して、人間の腫瘍の壊死などの炎症性サイトカインと内皮細胞刺激因子 (TNF) α やインターロイキン (il-1) ベータ (従来の炎症) は古典的な CD14 の完全な募集をトリガーするのに十分な+CD16–単球。ただし、血管内皮増殖因子 (VEGF) と tnf α (血管新生因子による炎症) の同時作用が、CD16 の輪廻を挑発する必要+単球3の血管新生プール。歴史的には、伝統的な Transwell 静的な条件、平行平板の流れ区域や μ スライド流室制度は、時間の in vitro11 で 1 つの末梢血白血球ポピュレーションの募集を定量的に解析に使用されています。 ,12,13。これらのプロトコルを検証しながら複数の単球サブポピュレーションの同時解析を許可より強固な方法がより洞察力があると見なされます。このような手法必要があります複数の対話および各それぞれの人口の異なる周波数のアカウントし、類似点と特異性のメカニズムの理解は、各単球を定義する募集カスケードサブセット。
同時に共焦点顕微鏡を用いた研究に異なる単球サブポピュレーションの渡り鳥のカスケードを可能にする流動場下における単球採用のタイムラプス イメージングに基づく方法を紹介します。このメソッドは、単球後毛細血管細静脈の循環の血行動態、白血球動員の生体内での主要な場所と同様に、血管内皮細胞炎症を模倣する特定の重要な機能を統合します。提案手法は、ひと臍帯からの分離の確立されたプロトコルを介して生成されるひと臍帯静脈血管内皮細胞 (新生活) を使用します。この臨床のリソースも臍静脈から分離でき、血管内皮細胞の合理的な利回りを提供しながら生物学的副産物として簡単に利用できるという利点があります。我々 も蛍光色素や蛍光を別の細胞成分と共焦点顕微鏡による単球の位置 (abluminal 対内腔) の明確な定義を区別する使用時間をかけて。ここで提示されたプロトコル開発した同時に測定する単球サブポピュレーションの転生レベル。また、他の白血球サブポピュレーションや採用プロセスを研究するこの方法を異なるバイオ マーカーおよびラベルの使用によって拡張できることに注意してください。
Protocol
Representative Results
Discussion
単球サブポピュレーションが炎症血管内皮膜を通して生まれ変わる方法の研究を詳述した手法を報告する.議論の方法は、位相差顕微鏡検査、また、単球の流れ3,11,19の下で採用を検討するものです代わりに共焦点顕微鏡を使用しました。タイムラプス イメージング用共焦点顕微鏡を使用しての主な利点の 1 つは、輪廻と単…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
博士ポール ブラッドは、原稿を読むとフィードバックを感謝いたします。A. S. デマンドレギュレーター サー ジュールとげ慈善海外信用、財政支援を受けてください。
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
Riferimenti
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