Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'integrità di barriera ematotesticolare iniettando inulina-FITC in testicoli. Si tratta di un metodo efficiente in vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare che può essere compromessa da elementi genetici e ambientali.
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Articolo metodologico
Un metodo In Vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare di Mouse
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Spermatogenesi sono lo sviluppo di spermatogoni in spermatozoi maturi nei tubuli seminiferi del testicolo. Questo processo è supportato da giunzioni delle cellule di Sertoli alla barriera ematotesticolare (BTB), che è la barriera più stretta di tessuto nel corpo dei mammiferi e segrega l'epitelio seminifero in due scomparti, una basale e un adluminal. La BTB crea un microambiente unico per le cellule germinali nella meiosi I / II e per lo sviluppo della postmeiotiche spermatidi in spermatozoi tramite spermiogenesi. Qui, descriviamo un test affidabile per monitorare l'integrità BTB del testicolo topo in vivo. Un intatto BTB blocca la diffusione di inulina FITC coniugato dal basale al compartimento apicale dei tubuli seminiferi. Questa tecnica è adatta per lo studio dei candidati gene, virus o tossici ambientali che possono influire sulla funzione BTB o integrità, con una procedura facile e un requisito minimo di abilità chirurgiche rispetto ai metodi alternativi.
Introduzione
Spermatogenesi mammifera sono considerato un processo altamente strutturato che comprende degli spermatogoni auto-rinnovamento e differenziazione attraverso spermatociti in spermatozoi aploidi tramite mitosi e meiosi spermiogenesi, durante il quale drammatica si verificano cambiamenti biochimici e morfologici. Cellule germinali in via di sviluppo sono progressivamente trasportate dalla base del tubulo seminifero verso il lume. Questo processo è regolato da contatti cellula-cellula fra le cellule germinali e le cellule Sertoli1,2. Cellule di Sertoli adiacenti formano il BTB che si trova vicino alla base del tub....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati sono stati approvati dal Comitato Università medica di Nanchino. Topi maschii C57BL/6 sono stati tenuti sotto condizioni controllate fotoperiodo e sono stati forniti con cibo e acqua.
1. preparati
-
Capillari di microiniezione
- Utilizzare i capillari microiniezione con un diametro esterno e interno dimeter lunghezza di 1.0 mm, 0.8 mm e 10,0 cm, rispettivamente.
- Tirare tubi capillari in vetro con un estrattore capillare (Figura 1A). Testare e regolare le impostazioni a seconda della macchina estrattore capillare che vien....
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Risultati
Il set-up sperimentale per eseguire il dosaggio di integrità BTB è illustrato nella Figura 1. Tirare e affinare i capillari di microiniezione con un estrattore capillare e frese per micropipetta, rispettivamente (Figura 1A e 1C). Il riscaldatore termostatico e attrezzature per il microinjection sono illustrate nella Figura 1B e 1D.
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Discussione
Spermatogenesi avviene nell'epitelio seminifero ed è un processo altamente ordinato e dinamico che è disciplinato dalle cellule germinali e le cellule somatiche (per es., cellule di Sertoli)13. La struttura BTB, che è costruita dalle cellule di Sertoli, divide l'epitelio seminifero in un basale e un compartimento apicale. Lo sviluppo delle cellule germinali meiotiche e aploidi avviene nel compartimento apicale che forma una barriera immunologica14.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Quest'opera è stata sostenuta dalla chiave nazionale di R & D programma della Cina (2016YFA0500902), National Foundation Natural Science of China (31471228, 31771653), la Fondazione di scienza di Jiangsu per illustri giovani studiosi (BK20150047), la scienza naturale Fondazione della provincia di Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) e il programma Innovative e imprenditoriale della provincia di Jiangsu a K.Z.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Estrattore capillare | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | diluizione a 1&volte; in ddH2O |
| 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Vetrini per microscopio ad adesione | CITOGLAS (Cina) | 80312-3161 | |
| Cloruro di cadmio | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Microscopio confocale | Zeiss (Germania) | LSM700 | |
| Carta senza polvere | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulina-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Capillari per microiniezione | Zhengtianyi (Cina) | BJ-40 | 1,0 mm &volte; 0,8 mm &volte; 100 mm |
| Smussatrice per micropipette | NARISHIGE (GIAPPONE) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (GIAPPONE) | 4583 | |
| Paraformaldeide | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodico | Merck (Germania) | P11011 | |
| Rasoio | Yashen (Cina) | ||
| Stereomicroscopio | Nikon (GIAPPONE) | SMZ1000 | |
| Saccarosio | Sangon Biotech (Cina) | A610498 | |
| Strumenti chirurgici | Stronger (Cina) | forbici, pinze, porta aghi | |
| Siringa | KDL (Cina) | 20163150518 | 0,45 mm & volte; 0,16 mm RW LB |
| riscaldatore termostatico | KELL (Nanjing, Cina) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7,6 | |||
| 0,2 M Tris | Sangon Biotech (Cina) | A600194 | |
| 1,37 M Nacl | Sangon Biotech (Cina | )A610476 |
Riferimenti
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al.
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Ristampe e permessi
