המחקר הנוכחי מתאר מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital לזיהום הקשורים biomaterial לאורך זמן מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מודל זה היא מערכת מבטיח משלימים מודלים בעלי חיים יונקים כגון עכבר מודלים לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.
זיהום הקשורים biomaterial (באי) הוא מהווה גורם מרכזי בכישלון biomaterials/רפואי התקנים. Staphylococcus aureus הוא אחד פתוגנים העיקריים בבאי. הנוכחי ניסיוני באי חיה בתרבית של מודלים כגון עכבר הדוגמניות יקר זמן רב, ולכן לא מתאים לניתוח תפוקה גבוהה. לפיכך, מודלים חדשניים כמערכות משלימים עבור חוקרים באי ויוו הם הרצויה. בהווה לומדים, כיוונו לפתח מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital של זיהום חיידקי בנוכחות biomaterials מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. בנוסף, התגובה מקרופאג שעורר נחקר. למטרה זו, אנו להביע חלבון פלואורסצנטי S. aureus ו דג זברה מהונדס עוברי המבטאים חלבונים פלורסנט ב מקרופאגים שלהם ופיתח הליך להחדיר חיידקים לבד או יחד עם microspheres לתוך השריר רקמות העובר. כדי לפקח על התקדמות זיהום חיידקי העוברים לחיות לאורך זמן, אנחנו המציאו שיטה פשוטה אך אמין של הניקוד מיקרוסקופיים של חיידקים פלורסנט. התוצאות ניקוד מיקרוסקופיים הראו כי כל העוברים עם יותר מ-20 המושבה יוצרי יחידות (CFU) של חיידקים הניב אות ניאון חיובית של חיידקים. במחקר השפעת פוטנציאל biomaterials על זיהום, קבענו המספרים CFU של S. aureus עם ובלי microspheres 10 מיקרומטר פוליסטירן (נ. ב10) בתור מודל biomaterials ב העוברים. יתר על כן, השתמשנו קובץ פרוייקט ObjectJ “דג זברה-Immunotest” הפועלים ImageJ לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית זיהום S. aureus עם ובלי PS10 לאורך זמן. תוצאות של שתי השיטות הראו מספר גבוה יותר של S. aureus עוברי נגועים עם microspheres מאשר בעוברי ללא microspheres, המציין את הרגישות של זיהום מוגבר בנוכחות biomaterial. לפיכך, המחקר הנוכחי מראה את הפוטנציאל של המודל העובר דג זברה ללמוד באי עם השיטות התפתחו כאן.
מגוון רחב של מכשירים רפואיים (המכונה “biomaterials”) משמשים יותר ויותר ברפואה המודרנית לשחזר או להחליף את גוף האדם חלקים1. עם זאת, ההשתלה של biomaterials predisposes מטופל זיהום, בשם הקשורים biomaterial זיהום (באי), אשר אחד הסיבוכים העיקריים של שתלים בניתוח. Staphylococcus aureus סטפילוקוקוס epidermidis שתי הנפוצות ביותר מיני החיידקים אחראי באי2,3,4,5,6בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מושתלים biomaterials טופס משטח ביופילמים חיידקים רגישים. יתר על כן, תגובה חיסונית מקומית עשויה להיות מופרע על ידי biomaterials מושתל, גורם היעילות מופחתת של חיסול חיידקים סיווג ראשוני של הדבקה חיידקים מתבצע בעיקר על ידי הסתננות נויטרופילים, אשר בתוקף מופחתת קיבולת אחרים בנוכחות שנוסף או מושתל biomaterial7. יתר על כן, מקרופאגים שחדר הרקמה אחרי זרם הראשונית של נויטרופילים phagocytose את החיידקים הנותרים אבל לא יעיל להרוג אותם intracellularly, עקב מטורף החיסונית איתות כי הוא תוצאה של המצאות משולב biomaterial וחיידקים8. לכן, הנוכחות של biomaterials יכול להקל על תאיים הישרדות של חיידקים9,10,11,12,13 biofilm היווצרות על מושתל 4,biomaterials14. כתוצאה מכך, באי עשוי להוביל לכשל, זקוק להחלפה של מושתל biomaterials, גורם תחלואה מוגברת ואת התמותה, אשפוז ממושך עם עלויות נוספות2,15.
מספר גדל והולך של אנטי-באי אסטרטגיות מתבצעת מפותחת2,16,17. In vivo הערכת יעילות של אסטרטגיות אלו הרלוונטיים במודלים של בעלי חיים היא חיונית. אולם, מסורתי באי בעלי חיים ניסיוניות (למשל, העכבר דגמים) הם בדרך כלל יקרים, זמן רב, ולכן לא מתאים לבדיקה תפוקה גבוהה של אסטרטגיות מרובות18. התפתחות של ביו-אופטיים טכניקות הדמיה המבוססת על זוהרים/פלורסנט תיוג של התאים המארחים וחיידקים עשוי לאפשר לניטור רציף של האינטראקציות התקדמות, המארח-פתוגן/מארח-חומר באי בודד חיות קטנות כגון עכברים18,19,20,21. עם זאת, טכניקה זו מורכבות יחסית עדיין בחיתוליו, ויש מספר בעיות שמחייבות לניתוח כמותי של באי18. למשל, מנה האתגר גבוהה נדרשת כדי להמחיש מושבת חיידקים. בנוסף, אור פיזור, ספיחה של אותות ביולומינסנציה/זריחה ברקמות של מבחן בתרבית של בעלי חיים צריך להיות גם התייחס18,19,21. לכן, חדשנית, חסכונית מודלים בעלי חיים המאפשר ויזואליזציה intravital וניתוח כמותי לאורך זמן הן מערכות משלימות יקר ללמוד באי ויוו.
דג זברה (עוברי) שימשו ככלי ויוו רב-תכליתי ניקוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, זיהום בפתוגנזה של מספר מינים חיידקי mycobacteria22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli26,24, Enterococcus faecalis25ו- staphylococci27. דג זברה עוברי יש יתרונות רבים כגון שקיפות אופטית, עלות תחזוקה נמוכה יחסית וכן אחזקת מערכת חיסונית דומה מאוד לזו יונקים28,29. זה הופך את העוברים דג זברה אורגניזם מודל כלכלי מאוד, חי ויזואליזציה intravital וניתוח של התקדמות הזיהום, המארח המשויך תגובות28,29. כדי לאפשר ויזואליזציה של התנהגות התא דג זברה ויוו, הטרנסגניים קווים עם סוגים שונים של תאים חיסוניים (למשל, מקרופאגים, נויטרופילים), אפילו עם מבנים subcellular fluorescently מתויג היה פותח28 ,29. בנוסף, שיעור גבוה רבייה של דג זברה מספק את האפשרות לפתח מערכות בחינה תפוקה גבוהה הכוללת הזרקה אוטומטית רובוטית, כימות פלורסצנטיות אוטומטיות ולאחר ניתוח רצף הרנ א27, 30.
במחקר הנוכחי, כיוונו לפתח מודל העובר דג זברה biomaterial-הקשורים בזיהום באמצעות טכניקות הדמיה זריחה. לשם כך, פיתחנו הליך להזריק חיידקים (S. aureus) בנוכחות biomaterial microspheres לתוך רקמות שריר של דג זברה העוברים. השתמשנו S. aureus RN4220 לביטוי mCherry חלבון פלואורסצנטי (S. aureus– mCherry), אשר נבנה כמתואר עבור S. aureus עוד זן10,31. הקו דג זברה מהונדס (mpeg1: קאךה/UAS) המבטאת קאךה חלבון פלואורסצנטי ירוק, המקרופאגים32 ו כחול ניאון פוליסטירן microspheres שימשו. במחקר הקודם, אנחנו הראו כי זריקה תוך שרירית של microspheres לתוך דג זברה עוברי לחקות biomaterial ההשתלה הוא ריאלי33. לנתח באופן כמותי את ההתקדמות של באי וחדירה תא המשויך של אחד העוברים לאורך זמן, היינו את קובץ הפרוייקט “דג זברה-Immunotest” המופעל בתוך “ObjectJ” (יישום plug-in עבור ImageJ) לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית חיידקים השוכנים ומקרופגים שחדר באזור ההזרקה של microspheres33. בנוסף, קבענו את המספרים של המושבה יוצרי יחידות (CFU) של חיידקים הנוכחות ואת היעדר microspheres של העוברים ללמוד ההשפעות האפשריות של biomaterials על זיהום. המחקר הנוכחי שלנו מדגים השיטות התפתחו כאן, העובר דג זברה הוא מודל בעלי חוליות מבטיח, הרומן לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.
זיהום הקשורים biomaterial (באי) הוא סיבוך רפואי חמור. הבנה טובה יותר של הפתוגנזה של באי ויוו תספק תובנות חדשות על מנת לשפר את מניעה וטיפול של באי. עם זאת, הנוכחי ניסיוני באי מודלים בעלי חיים כגון מודלים מאתר יקר, עתירי עבודה, והן דורשות אנשי סגל מומחים ברפואת טכניקות ניתוחיות מורכבות. לכן, מודלים א…
The authors have nothing to disclose.
מבחינה כלכלית, מחקר זה היה נתמך על ידי הפרויקט איביזה של התוכנית חומר ביו-רפואי (BMM), והיתה שותפה במימון הולנדית משרד חקירות כלכליות. המחברים רוצה להודות פרופ ‘ ד ר גרהם Lieschke מאוסטרליה, אוניברסיטת מונש למתן הקו דג זברה מהונדס (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
Cuvettes | BRAND | 759015 | |
Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
Petri-dish | Falcon | 353003 | |
Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |