Een zebravis Embryo Model voor In Vivo visualisatie en Intravital analyse van Biomaterial-geassocieerde goudhoudende Stafylokok infectie
Summary
De huidige studie beschrijft een zebravis embryo model voor in vivo visualisatie en intravital analyse van biomaterial-geassocieerde infectie na verloop van tijd op basis van fluorescentie microscopie. Dit model is een veelbelovende aanvulling op zoogdieren dierlijke modellen zoals Muismodellen voor het bestuderen van de biomaterial-geassocieerde infecties in vivo.
Abstract
Biomaterial-geassocieerde infectie (BAI) is een belangrijke oorzaak van het mislukken van biomaterialen/medische apparaten. Staphylococcus aureus is een van de belangrijkste ziekteverwekkers in BAI. Huidige BAI zoogdieren proefdieren modellen zoals Muismodellen zijn kostbaar en tijdrovend, en dus niet geschikt voor hoge doorvoer analyse. Dus, roman diermodellen als aanvullende systemen voor het onderzoeken van BAI in vivo gewenst zijn. In de huidige studie, we gericht op het ontwikkelen van een zebravis embryo model voor in vivo visualisatie en intravital analyse van bacteriële infectie in het bijzijn van biomaterialen gebaseerd op fluorescentie microscopie. Bovendien, werd de reactie uitgelokt macrofaag bestudeerd. Te dien einde, we gebruikt fluorescente proteïne-uiten S. aureus en transgene zebrafish embryo’s uiting van fluorescente proteïnen in hun macrofagen en ontwikkelde een procedure om te injecteren bacteriën alleen of samen met de microsferen in de spier weefsel van embryo’s. Als u wilt controleren de progressie van de bacteriële infectie in levende embryo’s na verloop van tijd, bedacht we een eenvoudige maar betrouwbare methode van microscopische scoren van fluorescerende bacteriën. De resultaten van microscopische scoren toonden aan dat alle embryo’s met meer dan 20 kolonie-vormende eenheden (kve) van bacteriën een positief fluorescent signaal van bacteriën leverde. De potentiële effecten van biomaterialen op infectie te studeren, vastbesloten wij de CFU aantallen S. aureus met en zonder polystyreen microsferen van 10 µm (PS10) als model biomaterialen in de embryo’s. Bovendien, we gewend het projectbestand ObjectJ “Zebrafish-Immunotest” uit ImageJ kwantificeren van de intensiteit van de fluorescentie van S. aureus -infectie met en zonder PS10 na verloop van tijd. Resultaten van beide methoden toonde hogere aantallen S. aureus in besmette embryo’s met microsferen dan in de embryo’s zonder microsferen, met vermelding van een verhoogde infectie gevoeligheid in aanwezigheid van de biomaterial. Dus toont de huidige studie het potentieel van de zebravis embryo model te studeren BAI met de methoden die hier ontwikkeld.
Introduction
Een verscheidenheid van medische hulpmiddelen (hierna aangeduid als “biomaterialen”) worden steeds meer gebruikt in de moderne geneeskunde op herstel of vervanging van menselijk lichaam deel1. De inplanting van biomaterialen predisposes echter een patiënt aan infectie, genaamd een biomaterial-geassocieerde infectie (BAI), die een belangrijke complicatie van implantaten in de chirurgie. Staphylococcus aureus en Staphylococcus epidermidis zijn de twee meest voorkomende bacteriële soorten verantwoordelijk voor BAI2,3,4,5,6. Geïmplanteerd biomaterialen vorm een gevoelig voor bacteriële biofilm vorming oppervlak. Bovendien is lokale immuunrespons kan worden gestoorde door de geïmplanteerde biomaterialen, waardoor verminderde effectiviteit van bacteriële goedkeuring. De eerste goedkeuring van bacteriën infecteren gebeurt voornamelijk door infiltreren neutrofielen, die sterk verminderde bactericide capaciteit in aanwezigheid van een ingevoegde of geïmplanteerd biomaterial7. Bovendien, macrofagen infiltreren het weefsel na de initiële toestroom van neutrofielen zal phagocytose de resterende bacteriën maar kan niet effectief doden hen intracellulair, als gevolg van de gestoorde immuun signalering dat is een gevolg van de gecombineerde aanwezigheid van de biomaterial en bacteriën8. Aldus, de aanwezigheid van biomaterialen intracellulair overleven van bacteriën9,10,11,12,13 en biofilm vorming op de geïmplanteerde kan vergemakkelijken biomaterialen4,14. Bijgevolg, BAI kan leiden tot het falen en behoefte aan vervanging van geïmplanteerde biomaterialen, waardoor verhoogde morbiditeit en mortaliteit en langdurige ziekenhuisopname met extra kosten2,15.
Een toenemend aantal anti-BAI strategieën worden ontwikkeld2,16,17. In vivo evaluatie van de werkzaamheid van deze strategieën in relevante diermodellen is essentieel. Traditionele experimentele BAI dierlijke modellen (bijvoorbeeld, -Muismodellen) zijn echter meestal duur, tijdrovend en dus niet geschikt voor hoge throughput testen van meerdere strategieën18. Recente ontwikkeling van bio-optische beeldvormingstechnieken op basis van bioluminescente/TL etikettering van gastheer cellen en bacteriën kan toestaan voor de continue bewaking van BAI progressie en host-pathogen/host-materiaal interacties in één kleine dieren zoals muizen18,19,20,21. Echter, deze techniek is relatief complexe en nog in de kinderschoenen, en verschillende kwesties moeten worden aangepakt voor kwantitatieve analyse van BAI18. Bijvoorbeeld, is een uitdaging van hoge dosis vereist voor het visualiseren van bacteriële kolonisatie. Daarnaast licht verstrooiing en adsorptie van bioluminescentie/fluorescentie signalen in weefsels van zoogdiercellen dieren moeten ook worden aangepakt18,19,21. Roman, kosteneffectieve diermodellen waardoor intravital visualisatie en kwantitatieve analyse na verloop van tijd zijn dus waardevolle aanvullende systemen voor het bestuderen van BAI in vivo.
Zebrafish (embryo’s) zijn gebruikt als een veelzijdig in vivo instrument voor het ontleden van de gastheer-pathogeen interacties en pathogenese van de infectie van verschillende bacteriesoorten zoals mycobacteriën22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25en staphylokokken26,27. Zebravis embryo’s hebben veel voordelen zoals optische transparantie, een relatief lage onderhoudskosten, en het bezit van een vrijwel gelijkwaardig aan die in zoogdieren28,29immuunsysteem. Dit maakt de zebravis embryo’s een zeer economische, levens modelorganisme voor intravital visualisatie en analyse van de progressie van de infectie en de bijbehorende host reacties28,29. Visualisatie van cel gedrag toestaan in vivo, transgene zebrafish lijnen met verschillende soorten immuuncellen (b.v., macrofagen en neutrofielen) en zelfs met fluorescently tagged subcellular structuren zijn ontwikkeld28 ,29. Het tempo hoge reproductie van de zebravis biedt bovendien de mogelijkheid van het ontwikkelen van hoge-doorvoer testsystemen met geautomatiseerde robot injectie, geautomatiseerde fluorescentie kwantificering en RNA sequentie analyse27, 30.
In de huidige studie, we gericht op het ontwikkelen van een zebravis embryo model voor biomaterial-geassocieerde infectie met behulp van fluorescentie beeldvormingstechnieken. Te dien einde ontwikkeld we een procedure voor het injecteren van bacteriën (S. aureus) in aanwezigheid van biomaterial microsferen in het spierweefsel van de zebravis embryo’s. We gebruikten S. aureus RN4220 waarin mCherry TL proteïne (S. aureus– mCherry), die werd gebouwd zoals elders beschreven voor een ander S. aureus -stam-10,31. De transgene zebrafish lijn (mpeg1: UAS/Kaede) uitdrukken Kaede groen fluorescent proteïne in de macrofagen32 en blauw TL polystyreen microsferen werden gebruikt. In een eerdere studie, hebben wij aangetoond dat intramusculaire injectie van microbolletjes in zebrafish embryo’s na te bootsen biomaterial implantatie haalbaar33. Om de progressie van BAI en infiltratie van de bijbehorende cel in één embryo’s na verloop van tijd kwantitatief te analyseren, gebruikten we het projectbestand “Zebrafish-Immunotest”, die wordt beheerd binnen “ObjectJ” (een plug-in voor ImageJ) te kwantificeren van de intensiteit van de fluorescentie van bacteriën die woonachtig en macrofagen infiltreren in de buurt van de injectieplaats microsferen33. Bovendien, wij vastbesloten de nummers van de kolonie-vormende eenheden (kve) van bacteriën in de aanwezigheid en de afwezigheid van microbolletjes in de embryo’s potentiële effecten van biomaterialen op infectie te bestuderen. Onze huidige studie toont aan dat met de methoden die hier ontwikkeld, de zebravis embryo een veelbelovende, roman gewervelde dieren model is voor het bestuderen van de biomaterial-geassocieerde infecties in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biomaterial-geassocieerde infectie (BAI) is een ernstige klinische complicatie. Een beter begrip van de pathogenese van BAI in vivo zou bieden nieuwe inzichten ter verbetering van de preventie en behandeling van BAI. Huidige experimentele BAI dierlijke modellen zoals lymfkliertest modellen zijn echter duur, arbeidsintensief, en vereisen gespecialiseerde personeel opgeleid in complexe chirurgische technieken. Deze modellen zijn daarom niet geschikt voor hoge doorvoer analyse. Aangezien eisen voor zebrafish embryo modellen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd financieel ondersteund door de IBIZA-project van de biomedische materiaal (BMM) programma en medegefinancierd door het Nederlandse ministerie van economische zaken. De auteurs bedank Prof. Dr. Graham Lieschke van Monash University in Australië voor het verstrekken van de zebravis transgene lijn (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
Riferimenti
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
- Otto, M. Staphylococcus epidermidis – the ‘accidental’ pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
- Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
- Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
- Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
- Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
- Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
- Darouiche, R. O. Current concepts – Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
- Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
- Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W., Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. , 307-354 (2013).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
- Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
- van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
- Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
- Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
- Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
- Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
- Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -. V., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. , 7-37 (2002).
- Chaplin, W. T. P. . Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , (2017).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
- Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
- Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
- Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
- Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).
