מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום
Summary
המחקר הנוכחי מתאר מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital לזיהום הקשורים biomaterial לאורך זמן מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מודל זה היא מערכת מבטיח משלימים מודלים בעלי חיים יונקים כגון עכבר מודלים לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.
Abstract
זיהום הקשורים biomaterial (באי) הוא מהווה גורם מרכזי בכישלון biomaterials/רפואי התקנים. Staphylococcus aureus הוא אחד פתוגנים העיקריים בבאי. הנוכחי ניסיוני באי חיה בתרבית של מודלים כגון עכבר הדוגמניות יקר זמן רב, ולכן לא מתאים לניתוח תפוקה גבוהה. לפיכך, מודלים חדשניים כמערכות משלימים עבור חוקרים באי ויוו הם הרצויה. בהווה לומדים, כיוונו לפתח מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital של זיהום חיידקי בנוכחות biomaterials מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. בנוסף, התגובה מקרופאג שעורר נחקר. למטרה זו, אנו להביע חלבון פלואורסצנטי S. aureus ו דג זברה מהונדס עוברי המבטאים חלבונים פלורסנט ב מקרופאגים שלהם ופיתח הליך להחדיר חיידקים לבד או יחד עם microspheres לתוך השריר רקמות העובר. כדי לפקח על התקדמות זיהום חיידקי העוברים לחיות לאורך זמן, אנחנו המציאו שיטה פשוטה אך אמין של הניקוד מיקרוסקופיים של חיידקים פלורסנט. התוצאות ניקוד מיקרוסקופיים הראו כי כל העוברים עם יותר מ-20 המושבה יוצרי יחידות (CFU) של חיידקים הניב אות ניאון חיובית של חיידקים. במחקר השפעת פוטנציאל biomaterials על זיהום, קבענו המספרים CFU של S. aureus עם ובלי microspheres 10 מיקרומטר פוליסטירן (נ. ב10) בתור מודל biomaterials ב העוברים. יתר על כן, השתמשנו קובץ פרוייקט ObjectJ “דג זברה-Immunotest” הפועלים ImageJ לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית זיהום S. aureus עם ובלי PS10 לאורך זמן. תוצאות של שתי השיטות הראו מספר גבוה יותר של S. aureus עוברי נגועים עם microspheres מאשר בעוברי ללא microspheres, המציין את הרגישות של זיהום מוגבר בנוכחות biomaterial. לפיכך, המחקר הנוכחי מראה את הפוטנציאל של המודל העובר דג זברה ללמוד באי עם השיטות התפתחו כאן.
Introduction
מגוון רחב של מכשירים רפואיים (המכונה “biomaterials”) משמשים יותר ויותר ברפואה המודרנית לשחזר או להחליף את גוף האדם חלקים1. עם זאת, ההשתלה של biomaterials predisposes מטופל זיהום, בשם הקשורים biomaterial זיהום (באי), אשר אחד הסיבוכים העיקריים של שתלים בניתוח. Staphylococcus aureus סטפילוקוקוס epidermidis שתי הנפוצות ביותר מיני החיידקים אחראי באי2,3,4,5,6בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מושתלים biomaterials טופס משטח ביופילמים חיידקים רגישים. יתר על כן, תגובה חיסונית מקומית עשויה להיות מופרע על ידי biomaterials מושתל, גורם היעילות מופחתת של חיסול חיידקים סיווג ראשוני של הדבקה חיידקים מתבצע בעיקר על ידי הסתננות נויטרופילים, אשר בתוקף מופחתת קיבולת אחרים בנוכחות שנוסף או מושתל biomaterial7. יתר על כן, מקרופאגים שחדר הרקמה אחרי זרם הראשונית של נויטרופילים phagocytose את החיידקים הנותרים אבל לא יעיל להרוג אותם intracellularly, עקב מטורף החיסונית איתות כי הוא תוצאה של המצאות משולב biomaterial וחיידקים8. לכן, הנוכחות של biomaterials יכול להקל על תאיים הישרדות של חיידקים9,10,11,12,13 biofilm היווצרות על מושתל 4,biomaterials14. כתוצאה מכך, באי עשוי להוביל לכשל, זקוק להחלפה של מושתל biomaterials, גורם תחלואה מוגברת ואת התמותה, אשפוז ממושך עם עלויות נוספות2,15.
מספר גדל והולך של אנטי-באי אסטרטגיות מתבצעת מפותחת2,16,17. In vivo הערכת יעילות של אסטרטגיות אלו הרלוונטיים במודלים של בעלי חיים היא חיונית. אולם, מסורתי באי בעלי חיים ניסיוניות (למשל, העכבר דגמים) הם בדרך כלל יקרים, זמן רב, ולכן לא מתאים לבדיקה תפוקה גבוהה של אסטרטגיות מרובות18. התפתחות של ביו-אופטיים טכניקות הדמיה המבוססת על זוהרים/פלורסנט תיוג של התאים המארחים וחיידקים עשוי לאפשר לניטור רציף של האינטראקציות התקדמות, המארח-פתוגן/מארח-חומר באי בודד חיות קטנות כגון עכברים18,19,20,21. עם זאת, טכניקה זו מורכבות יחסית עדיין בחיתוליו, ויש מספר בעיות שמחייבות לניתוח כמותי של באי18. למשל, מנה האתגר גבוהה נדרשת כדי להמחיש מושבת חיידקים. בנוסף, אור פיזור, ספיחה של אותות ביולומינסנציה/זריחה ברקמות של מבחן בתרבית של בעלי חיים צריך להיות גם התייחס18,19,21. לכן, חדשנית, חסכונית מודלים בעלי חיים המאפשר ויזואליזציה intravital וניתוח כמותי לאורך זמן הן מערכות משלימות יקר ללמוד באי ויוו.
דג זברה (עוברי) שימשו ככלי ויוו רב-תכליתי ניקוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, זיהום בפתוגנזה של מספר מינים חיידקי mycobacteria22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli26,24, Enterococcus faecalis25ו- staphylococci27. דג זברה עוברי יש יתרונות רבים כגון שקיפות אופטית, עלות תחזוקה נמוכה יחסית וכן אחזקת מערכת חיסונית דומה מאוד לזו יונקים28,29. זה הופך את העוברים דג זברה אורגניזם מודל כלכלי מאוד, חי ויזואליזציה intravital וניתוח של התקדמות הזיהום, המארח המשויך תגובות28,29. כדי לאפשר ויזואליזציה של התנהגות התא דג זברה ויוו, הטרנסגניים קווים עם סוגים שונים של תאים חיסוניים (למשל, מקרופאגים, נויטרופילים), אפילו עם מבנים subcellular fluorescently מתויג היה פותח28 ,29. בנוסף, שיעור גבוה רבייה של דג זברה מספק את האפשרות לפתח מערכות בחינה תפוקה גבוהה הכוללת הזרקה אוטומטית רובוטית, כימות פלורסצנטיות אוטומטיות ולאחר ניתוח רצף הרנ א27, 30.
במחקר הנוכחי, כיוונו לפתח מודל העובר דג זברה biomaterial-הקשורים בזיהום באמצעות טכניקות הדמיה זריחה. לשם כך, פיתחנו הליך להזריק חיידקים (S. aureus) בנוכחות biomaterial microspheres לתוך רקמות שריר של דג זברה העוברים. השתמשנו S. aureus RN4220 לביטוי mCherry חלבון פלואורסצנטי (S. aureus– mCherry), אשר נבנה כמתואר עבור S. aureus עוד זן10,31. הקו דג זברה מהונדס (mpeg1: קאךה/UAS) המבטאת קאךה חלבון פלואורסצנטי ירוק, המקרופאגים32 ו כחול ניאון פוליסטירן microspheres שימשו. במחקר הקודם, אנחנו הראו כי זריקה תוך שרירית של microspheres לתוך דג זברה עוברי לחקות biomaterial ההשתלה הוא ריאלי33. לנתח באופן כמותי את ההתקדמות של באי וחדירה תא המשויך של אחד העוברים לאורך זמן, היינו את קובץ הפרוייקט “דג זברה-Immunotest” המופעל בתוך “ObjectJ” (יישום plug-in עבור ImageJ) לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית חיידקים השוכנים ומקרופגים שחדר באזור ההזרקה של microspheres33. בנוסף, קבענו את המספרים של המושבה יוצרי יחידות (CFU) של חיידקים הנוכחות ואת היעדר microspheres של העוברים ללמוד ההשפעות האפשריות של biomaterials על זיהום. המחקר הנוכחי שלנו מדגים השיטות התפתחו כאן, העובר דג זברה הוא מודל בעלי חוליות מבטיח, הרומן לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהום הקשורים biomaterial (באי) הוא סיבוך רפואי חמור. הבנה טובה יותר של הפתוגנזה של באי ויוו תספק תובנות חדשות על מנת לשפר את מניעה וטיפול של באי. עם זאת, הנוכחי ניסיוני באי מודלים בעלי חיים כגון מודלים מאתר יקר, עתירי עבודה, והן דורשות אנשי סגל מומחים ברפואת טכניקות ניתוחיות מורכבות. לכן, מודלים א…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מבחינה כלכלית, מחקר זה היה נתמך על ידי הפרויקט איביזה של התוכנית חומר ביו-רפואי (BMM), והיתה שותפה במימון הולנדית משרד חקירות כלכליות. המחברים רוצה להודות פרופ ‘ ד ר גרהם Lieschke מאוסטרליה, אוניברסיטת מונש למתן הקו דג זברה מהונדס (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
Riferimenti
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
- Otto, M. Staphylococcus epidermidis – the ‘accidental’ pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
- Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
- Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
- Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
- Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
- Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
- Darouiche, R. O. Current concepts – Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
- Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
- Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W., Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. , 307-354 (2013).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
- Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
- van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
- Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
- Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
- Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
- Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
- Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -. V., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. , 7-37 (2002).
- Chaplin, W. T. P. . Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , (2017).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
- Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
- Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
- Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
- Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).
