Un modello di embrione di Zebrafish per nel Vivo visualizzazione e analisi videomicroscopia del biomateriale-collegata dello stafilococco aureo infezione
Summary
Il presente studio descrive un modello di embrione di zebrafish per videomicroscopia analisi di biomateriale infezione nel corso del tempo basato su microscopia di fluorescenza e la visualizzazione in vivo. Questo modello è un promettente sistema integrando modelli animali mammiferi quali modelli murini per lo studio delle infezioni associate al biomateriale in vivo.
Abstract
Infezione di biomateriale-collegata (BAI) è delle principali cause del fallimento di biomateriali/dispositivi medici. Lo Staphylococcus aureus è uno dei principali patogeni a BAI. Corrente sperimentale animale mammifero di BAI modelli come modelli murini sono costosi e che richiede tempo e quindi non è adatto per analisi di rendimento elevato. Così, nuovi modelli animali come sistemi complementari per lo studio in vivo di BAI sono desiderati. Nel presente studio, abbiamo mirato a sviluppare un modello di embrione di zebrafish per la visualizzazione in vivo e videomicroscopia analisi dell’infezione batterica in presenza di biomateriali basati su microscopia di fluorescenza. Inoltre, è stata studiata la risposta dei macrofagi provocata. A tal fine, abbiamo usato fluorescente che esprimono proteine S. aureus e gli embrioni di zebrafish transgenici che esprimono le proteine fluorescenti in loro macrofagi e sviluppato una procedura per iniettare i batteri da soli o insieme a microsfere nel muscolo tessuto di embrioni. Per monitorare la progressione della infezione batterica negli embrioni dal vivo nel corso del tempo, abbiamo messo a punto un metodo semplice ma affidabile di scoring microscopica di batteri fluorescenti. I risultati di segnare al microscopio ha mostrato che tutti gli embrioni con più di 20 unità formanti colonie (CFU) di batteri ha prodotto un positivo segnale fluorescente di batteri. Per studiare gli effetti potenziali di biomateriali sull’infezione, abbiamo determinato i numeri CFU di S. aureus con e senza microsfere di 10 µm in polistirene (PS10) come biomateriali modello negli embrioni. Inoltre, abbiamo usato il file di progetto ObjectJ “Zebrafish-Immunotest” operano in ImageJ per quantificare l’intensità della fluorescenza di S. aureus infezione con e senza PS10 nel corso del tempo. Risultati da entrambi i metodi hanno mostrato un numero maggiore di S. aureus infetti embrioni con microsfere che negli embrioni senza microsfere, che indica una suscettibilità aumentato di infezione in presenza il biomateriale. Così, lo studio presente indica il potenziale del modello di embrione di zebrafish per studiare BAI con i metodi sviluppati qui.
Introduction
Una varietà di dispositivi medici (denominato “biomateriali”) sono sempre più utilizzati nella medicina moderna per ripristinare o sostituire parti di corpo umano1. Tuttavia, l’impianto di biomateriali predispone un paziente all’infezione, chiamato un infezione biomateriale-collegata (BAI), che è una complicazione importante di impianti in chirurgia. Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis sono due specie di batteri più prevalente responsabile BAI2,3,4,5,6. Impiantato forma biomateriali una superficie sensibile alla formazione di biofilm batterico. Inoltre, la risposta immunitaria locale può essere squilibrato di biomateriali impiantati, causando ridotta efficacia della clearance batterica. Il gioco iniziale di infettare i batteri viene eseguito principalmente da infiltrazione dei neutrofili, che hanno fortemente ridotto la capacità battericida in presenza di un inserito o impiantati biomateriale7. Inoltre, i macrofagi infiltranti il tessuto dopo l’iniziale afflusso dei neutrofili verrà fagocitare i batteri rimanenti ma non può efficacemente si uccidono intracellulare, dovuto immunitario squilibrato di segnalazione che è una conseguenza della presenza combinata di il biomateriale e batteri8. Così, la presenza di biomateriali può facilitare la sopravvivenza intracellulare di batteri9,10,11,12,13 e biofilm formazione sull’impiantati biomateriali4,14. Di conseguenza, BAI potrebbe portare al fallimento e bisogno per la sostituzione dei biomateriali impiantati, causando un aumento della morbilità e mortalità e l’ospedalizzazione prolungata con costi aggiuntivi2,15.
Un numero crescente di strategie anti-BAI è stati sviluppati2,16,17. Valutazione in vivo dell’efficacia di queste strategie in modelli animali pertinenti è essenziale. Tuttavia, tradizionale BAI modelli animali (es. modelli di mouse, ) sono solitamente costosi, che richiede tempo e quindi non adatti per elevato throughput test di più strategie18. Recente sviluppo di tecniche di imaging bio-ottico basato su bioluminescenti/fluorescente etichettatura di batteri e cellule dell’ospite può permettere per il monitoraggio continuo delle interazioni di progressione e materiale-ospite-agente patogeno/host BAI in singoli piccoli animali come topi18,19,20,21. Tuttavia, questa tecnica è relativamente complessa e ancora nella sua infanzia, e diversi problemi devono essere affrontati per l’analisi quantitativa di BAI18. Per esempio, per visualizzare la colonizzazione batterica è necessaria una dose alta sfida. Inoltre, light scattering e adsorbimento di bioluminescenza/fluorescenza segnali nei tessuti dei mammiferi: saggio gli animali devono anche essere affrontate18,19,21. Di conseguenza, romanzo, conveniente modelli animali, consentendo la visualizzazione videomicroscopia e analisi quantitativa nel corso del tempo sono sistemi complementari importanti per lo studio in vivo di BAI.
Zebrafish (embrioni) sono stati usati come uno strumento versatile in vivo per la dissezione interazioni ospite-patogeno e patogenesi di infezione di varie specie batteriche come micobatteri22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25e stafilococchi26,27. Embrioni di zebrafish presentano molti vantaggi quali trasparenza ottica, un relativamente basso costo di manutenzione e possesso di un sistema immunitario molto simile a quella di mammiferi28,29. Questo rende gli embrioni di zebrafish organismo modello altamente economica, living per videomicroscopia visualizzazione e l’analisi della progressione di infezione e host associato risposte28,29. Per permettere la visualizzazione del comportamento delle cellule in vivo, transgenici zebrafish linee con diversi tipi di cellule del sistema immunitario (per esempio, macrofagi e neutrofili) e anche con strutture subcellulari fluorescente contrassegnati sono stati sviluppati28 ,29. Inoltre, il tasso di riproduzione alta di zebrafish fornisce la possibilità di sviluppare sistemi di test di velocità effettiva elevata con iniezione robot automatizzati, quantificazione automatizzata di fluorescenza e RNA sequenza analisi27, 30.
Nello studio presente, abbiamo mirato a sviluppare un modello di embrione di zebrafish per infezione biomateriale-collegata usando tecniche di imaging di fluorescenza. A tal fine, abbiamo sviluppato una procedura per iniettare batteri (Staphylococcus aureus) alla presenza di microsfere di biomateriale nel tessuto muscolare di embrioni di zebrafish. Abbiamo usato lo Staphylococcus aureus RN4220 esprimenti mCherry proteina fluorescente (s. aureus– mCherry), che è stata costruita come descritto altrove per10,un altro ceppo di Staphylococcus aureus 31. La linea di zebrafish transgenici (mpeg1: UAS/Kaede) esprimendo Kaede proteina verde fluorescente in macrofagi32 e blu fluorescente microsfere in polistirolo sono stati usati. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che l’iniezione intramuscolare di microsfere negli embrioni di zebrafish per imitare l’impianto biomateriale è fattibile33. Per analizzare quantitativamente la progressione di BAI e infiltrazione delle cellule associato a singoli embrioni nel corso del tempo, abbiamo usato il file di progetto “Zebrafish-Immunotest” che è gestito all’interno di “ObjectJ” (un plug-in per ImageJ) per quantificare l’intensità di fluorescenza di batteri che risiedono e macrofagi che si infiltrano nelle vicinanze del sito di iniezione di microsfere33. Inoltre, abbiamo determinato i numeri delle formanti colonie unità (CFU) di batteri in presenza ed assenza di microsfere negli embrioni per studiare gli effetti potenziali di biomateriali sull’infezione. Il nostro studio presente dimostra che con i metodi sviluppati qui, l’embrione di zebrafish è un promettente, romanzo vertebrato modello animale per lo studio delle infezioni associate al biomateriale in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Infezione di biomateriale-collegata (BAI) è una grave complicazione clinica. Una migliore comprensione della patogenesi di BAI in vivo sarebbe fornire nuove conoscenze per migliorare la prevenzione e il trattamento di BAI. Tuttavia, corrente modelli animali sperimentali BAI come modelli murini sono costosi, laborioso e richiedono personale specializzato addestrato nelle tecniche chirurgiche complesse. Di conseguenza, questi modelli non sono adatti per alta analisi di rendimento. Poiché i requisiti per i modelli di embr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziariamente supportato dal progetto IBIZA del programma materiale biomedico (BMM) e co-finanziato dal Ministero olandese degli affari economici. Gli autori desidera ringraziare il Dr. Graham Lieschke da Monash University, Australia per fornire la linea transgenica di zebrafish (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
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