Um modelo de embrião de Zebrafish para na visualização de Vivo e Intravital análise de biomateriais-associado Staphylococcus aureus infecção
Summary
O presente estudo descreve um modelo de embrião de zebrafish para visualização in vivo e intravital análise de infecção biomaterial associada ao longo do tempo com base em microscopia de fluorescência. Este modelo é um sistema promissor complementando modelos animais mamíferos, tais como modelos de rato para o estudo in vivo de infecções associadas a biomaterial.
Abstract
Infecção associada biomaterial (BAI) é das principais causas do fracasso de biomateriais/dispositivos médicos. Staphylococcus aureus é um dos principais patógenos em BAI. Atual animal experimental de mamíferos BAI modelos tais como modelos de mouse são dispendiosos e demorados e, portanto, não é adequado para análise de alto rendimento. Assim, novos modelos animais como sistemas complementares para investigar BAI in vivo são desejados. No presente estudo, visamos desenvolver um modelo de embrião de zebrafish para visualização in vivo e intravital análise de infecção bacteriana na presença de biomateriais baseado em microscopia de fluorescência. Além disso, estudou-se a resposta de macrófagos provocado. Para este fim, usamos de expressar a proteína fluorescente S. aureus e embriões de zebrafish transgênicos expressando proteínas fluorescentes em seus macrófagos e desenvolveu um procedimento para injetar o músculo bactérias sozinhos ou em conjunto com microesferas tecido de embriões. Para monitorar a progressão da infecção bacteriana em embriões ao vivo ao longo do tempo, criámos um método simples mas confiável de marcar microscópica de bactérias fluorescentes. Os resultados de marcar microscópica mostraram que todos os embriões com mais de 20 unidades de formadoras de Colônia (UFC) de bactérias produziram um positivo sinal fluorescente de bactérias. Para estudar os efeitos potenciais de biomateriais na infecção, determinamos os números CFU de S. aureus com e sem 10 µm microesferas de poliestireno (PS10) como biomateriais modelo nos embriões. Além disso, usamos o arquivo de projeto ObjectJ “Zebrafish-Immunotest” operando em ImageJ para quantificar a intensidade de fluorescência da infecção por S. aureus com e sem PS10 ao longo do tempo. Os resultados de ambos os métodos mostraram números mais altos de S. aureus em embriões infectados com microesferas que em embriões sem microesferas, indicando uma susceptibilidade aumentada infecção na presença do biomaterial. Assim, o presente estudo mostra o potencial do modelo de embrião de peixe-zebra para estudar BAI com os métodos desenvolvidos aqui.
Introduction
Uma variedade de dispositivos médicos (referido como “biomateriais”) são cada vez mais utilizados na medicina moderna para restaurar ou substituir as partes de corpo humano1. No entanto, a implantação de biomateriais predispõe um paciente à infecção, chamada uma infecção associada biomaterial (BAI), que é uma grande complicação dos implantes em cirurgia. Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis são duas espécies bacterianas mais prevalentes responsáveis por BAI2,3,4,5,6. Implantou a forma de biomateriais uma superfície suscetível à formação de biofilme bacteriano. Além disso, resposta imune local pode ser perturbada pelos biomateriais implantados, causando reduzida eficácia do apuramento bacteriana. A autorização inicial de infectar bactérias é realizada principalmente por infiltração de neutrófilos, fortemente reduzida capacidade bactericida na presença de um inserido ou implantado biomaterial7. Além disso, os macrófagos infiltrando o tecido após o fluxo inicial de neutrófilos será fagocitam as bactérias restantes, mas não pode efetivamente matá-los intracelular, devido a demente imunológico sinalizando que é uma consequência da presença combinada de o biomaterial e bactérias8. Assim, a presença de biomateriais pode facilitar a sobrevivência intracelular de bactérias9,10,11,12,13 e biofilme formação sobre o implantado biomateriais4,14. Consequentemente, BAI pode levar ao fracasso e a necessidade de substituição de biomateriais implantados, causando aumento de morbilidade e mortalidade e hospitalização prolongada com custos adicionais2,15.
Um número crescente de estratégias anti-BAI está sendo desenvolvidos2,16,17. Avaliação in vivo da eficácia destas estratégias em modelos animais relevantes é essencial. No entanto, a tradicional BAI animais modelos experimentais (por exemplo, modelos de rato, ) são geralmente caro, demorado e, portanto, não é adequado para testar a alta taxa de transferência de múltiplas estratégias18. O desenvolvimento recente de técnicas bio-óptico de imagem baseado em bioluminescentes/fluorescente rotular de bactérias e células hospedeiras pode permitir o monitoramento contínuo das interações hospedeiro-patógeno/hospedeiro-material e progressão de BAI em único pequenos animais como ratos18,19,20,21. No entanto, esta técnica é relativamente complexa e ainda em sua infância, e várias questões devem ser resolvidas para análise quantitativa de BAI18. Por exemplo, uma dose de alto desafio é necessário para visualizar a colonização bacteriana. Além disso, a luz espalhamento e adsorção de bioluminescência/fluorescência sinais em tecidos de mamíferos teste os animais também devem ser abordadas de19,18,21. Portanto, novo, cost-effective modelos animais, permitindo a visualização intravital e análise quantitativa ao longo do tempo são valiosos sistemas complementares para o estudo in vivo do BAI.
Zebrafish (embriões) têm sido usados como uma ferramenta versátil em vivo para dissecar as interações patógeno-hospedeiro e patogênese da infecção de diversas espécies bacterianas como micobactérias22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, estafilococose Enterococcus faecalis2526,27. Zebrafish embriões têm muitas vantagens tais como a transparência óptica, um relativamente baixo custo de manutenção e a posse de um sistema imune altamente similar em mamíferos28,29. Isto torna o zebrafish embriões um organismo modelo altamente econômico, vivendo para visualização intravital e análise da progressão da infecção e hospedeiro associados respostas28,29. Para permitir a visualização do comportamento de célula zebrafish transgênicos, vivo em linhas com diferentes tipos de células do sistema imunológico (por exemplo,, de macrófagos e neutrófilos) e até mesmo com estruturas subcelulares fluorescente etiquetadas foram desenvolvidos28 ,29. Além disso, a taxa de reprodução alta de zebrafish fornece a possibilidade de desenvolver sistemas de teste de alto rendimento com injeção robótica automatizada, quantificação de fluorescência automatizada e de análise de sequência de RNA27, 30.
No presente estudo, objetivou-se desenvolver um modelo de embrião de zebrafish para infecção associada biomaterial, usando técnicas da imagem latente de fluorescência. Para este fim, nós desenvolvemos um procedimento para injetar bactérias (S. aureus) na presença de microesferas de biomaterial no tecido muscular de embriões de peixe-zebra. Usamos o S. aureus RN4220 expressando mCherry proteína fluorescente (s. aureus– mCherry), que foi construída conforme descrito em outro lugar para S. aureus outra estirpe de10,31. A linha de zebrafish transgênicos (mpeg1: UAS/Kaede) expressando Kaede proteína verde fluorescente nos macrófagos32 e azul fluorescente poliestireno microesferas foram usados. Em um estudo anterior, mostramos que a injeção intramuscular de microesferas em embriões de peixe-zebra para imitar o implante do biomaterial é viável33. Para analisar quantitativamente a progressão de BAI e infiltração de célula associada em embriões única ao longo do tempo, usamos o arquivo de projeto “Zebrafish-Immunotest”, que é operado dentro de “ObjectJ” (um plug-in para ImageJ) para quantificar a intensidade da fluorescência de as bactérias que residem e macrófagos, infiltrando-se nas proximidades do local da injeção de microesferas33. Além disso, nós determinamos os números de formadoras de Colônia (UFC) de unidades de bactérias na presença e na ausência de microesferas nos embriões para estudar os efeitos potenciais de biomateriais na infecção. Nosso presente estudo demonstra que, com os métodos desenvolvidos aqui, o embrião de zebrafish é promissor, a novo vertebrado modelo animal para o estudo in vivo de infecções associadas a biomaterial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Infecção associada biomaterial (BAI) é uma complicação clínica grave. Uma melhor compreensão da patogênese de BAI em vivo proporcionaria novas ideias para melhorar a prevenção e tratamento do BAI. No entanto, atual BAI animais modelos experimentais tais como modelos de murino são caro, trabalhoso e exigem pessoal especializado treinado em técnicas cirúrgicas complexas. Portanto, estes modelos não são adequados para análise de alto rendimento. Desde que os requisitos para os modelos de embrião de zebrafis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financeiramente apoiado pelo projecto IBIZA do programa materiais biomédicos (BMM) e co-financiado pelo Ministério dos assuntos económicos. Os autores gostaria de agradecer a Prof. Dr. Graham Lieschke da Universidade de Monash, Austrália para fornecer a linha de zebrafish transgênicos (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
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