Данио рерио эмбриона модель визуализации Vivo и связанные прижизненной анализ биоматериала стафилококк инфекций
Summary
Настоящее исследование описывает модель zebrafish эмбриона для визуализации в естественных условиях и прижизненной анализа биоматериал ассоциированной инфекции с течением времени на основе микроскопии флуоресцирования. Эта модель является многообещающей системой, дополняя млекопитающих животных моделей, таких как мыши модели для изучения биоматериал ассоциированных инфекций в естественных условиях.
Abstract
Биоматериал ассоциированной инфекции (бай) является одной из основных причин отказа биоматериалов/медицинских устройств. Золотистого стафилококка является одним из основных возбудителей в бай. Текущие экспериментальные бай млекопитающих животных моделей, такие, как мыши модели являются дорогостоящим и трудоемким и поэтому не подходят для высокой пропускной способности анализа. Таким образом желательны Роман животных моделей как дополнительных систем для расследования бай в естественных условиях. В настоящем исследовании, мы стремились разработать модель zebrafish эмбриона в естественных условиях визуализации и прижизненной анализа бактериальной инфекции при наличии биоматериалов, основанный на микроскопии флуоресцирования. Кроме того был изучен ответ спровоцировали макрофагов. С этой целью мы использовали флуоресцентный белок выражая S. aureus и трансгенных данио рерио эмбрионов, выражая флуоресцентных белков в их макрофагов и разработала процедуру впрыснуть бактерий в одиночку или вместе с микросфер в мышцы ткани эмбрионов. Чтобы контролировать прогрессирование бактериальной инфекции в прямом эмбрионов с течением времени, мы разработали простой, но надежный метод микроскопических скоринга флуоресцентные бактерий. Результаты от микроскопических скоринга показали, что все эмбрионы с более чем 20 образуя колонии единиц (CFU) бактерий принесло положительный сигнал флуоресцентные бактерий. Для изучения потенциального воздействия биоматериалов на инфекции, мы определили CFU количество S. aureus с и без 10 мкм Полистирольные микросферы (10Л.С.) как модель биоматериалов в эмбрионы. Кроме того мы использовали файл проекта ObjectJ «У рыбок данио-Immunotest» работает в ImageJ для количественного определения интенсивности флуоресценции S. aureus инфекции с и без PS10 с течением времени. Результаты обоих методов показали выше числа S. aureus в зараженных эмбрионов с микросферы чем эмбрионов без микросферы, показывающее увеличение инфекции, чувствительности возбудителя в присутствии биоматериала. Таким образом настоящее исследование показывает потенциал в zebrafish эмбриона модели для изучения бай с методов, разработанных здесь.
Introduction
Целый ряд медицинских приборов (упоминаемые как «биоматериалов») все чаще используются в современной медицине для восстановления или замены частей человеческого тела1. Однако имплантации биоматериалов предрасполагает пациента к инфекции, называется биоматериал ассоциированной инфекции (бай), которая является серьезным осложнением имплантатов в хирургии. Золотистый стафилококк и стафилококк являются два наиболее распространенных видов бактериальных ответственных за бай2,3,4,5,6. Имплантированные биоматериалов формы поверхности подвержены бактериальные биопленки. Кроме того местный иммунный ответ может быть нарушенный имплантированных биоматериалов, вызывая снижение эффективности бактериальных распродажа. Первоначальный Распродажа заражения бактериями осуществляется главным образом путем проникновения нейтрофилов, которые сильно сократили бактерицидной потенциала при наличии вставленных или имплантированные биоматериала7. Кроме того макрофаги, проникают в ткани после того, как первоначальный приток нейтрофилов будет фагоцитировать оставшиеся бактерии, но не может эффективно убить их внутриклеточно, из-за ненормальный иммунной сигнализации, что является следствием комбинированного присутствия биоматериала и бактерии8. Таким образом присутствие биоматериалов могут облегчить внутриклеточных выживания бактерий9,10,11,12,13 и биопленки формирования на имплантированный биоматериалов4,14. Следовательно бай может привести к провалу и необходимость замены биоматериалов имплантированных, вызывая увеличение заболеваемости и смертности и длительной госпитализации с2,дополнительные расходы15.
В настоящее время все большее количество анти бай стратегий развитых2,16,17. В естественных условиях оценки эффективности этих стратегий в соответствующих моделях животных имеет важное значение. Однако традиционные экспериментальных животных модели бай (например, модели мыши) обычно дорого, много времени и поэтому не подходят для высокой пропускной способности тестирования нескольких стратегий18. Последние разработки био оптических изображений методы, основанные на биолюминесцентных/люминесцентные маркировки клеток хозяина и бактерий может позволить для непрерывного мониторинга бай прогрессии и хост возбудитель/хост материал взаимодействия в единый зверюшек Например, мышей18,19,,2021. Однако этот метод является довольно сложной и все еще в зачаточном состоянии, и некоторые вопросы должны быть решены для количественного анализа бай18. Например высокая задача дозы требуется визуализировать бактериальной колонизации. Кроме того, свет рассеяния и адсорбции биолюминесценции/флюоресценцию сигналов в тканях млекопитающих теста, который животные также должны быть рассмотрены18,19,21. Таким образом роман, экономически Животные модели, позволяя для прижизненной визуализации и количественного анализа с течением времени являются ценные дополнительные системы для изучения бай в естественных условиях.
Данио рерио (зародышей) были использованы как универсальный инструмент в естественных условиях для рассечения хост возбудитель взаимодействий и инфекции патогенез ряда бактериальных видов, таких как микобактерий22, Pseudomonas aeruginosa23, Кишечная палочка24, Enterococcus faecalis25и стафилококки26,27. Данио рерио эмбрионы имеют много преимуществ, таких как Оптическая прозрачность, относительно низкая стоимость обслуживания и владение иммунной системы, весьма аналогичны в млекопитающих28,29. Это делает zebrafish эмбриона высоко экономических, Жилая модельный организм для прижизненной визуализации и анализа прогрессирования инфекции и связанный с ним ведущий ответы28,29. Чтобы разрешить визуализации ячейки поведения в естественных условиях, трансгенных данио рерио линий с различными типами иммунных клеток (например,, макрофагов и нейтрофилов) и даже с тегами, дневно внутриклеточных структур были разработаны28 ,29. Кроме того уровень высоких репродукций данио рерио обеспечивает возможность разработки тестовых систем высокой пропускной способности показывая автоматизированный робот инъекции, автоматизированных флуоресценции количественной оценки и РНК последовательности анализа27, 30.
В настоящем исследовании мы стремились разработать модель zebrafish эмбриона биоматериал ассоциированной инфекции, используя методы визуализации флуоресценции. С этой целью мы разработали процедуру придать бактерий (S. aureus) в присутствии биоматериала микросферы в мышечную ткань zebrafish эмбриона. Мы использовали S. aureus RN4220 выражая mCherry флуоресцентный белок (S. aureus– mCherry), который был построен как описано для другой S. aureus штамм10,–31. Данио рерио трансгенные линии (mpeg1: бас/Каэдэ) выражая Каэдэ Зеленый флуоресцирующий белок в макрофаги32 и синий флуоресцентный Полистирольные микросферы были использованы. В предыдущем исследовании мы показали, что внутримышечной инъекции в zebrafish эмбриона имитировать имплантация биоматериала микросфер является осуществимым33. Чтобы количественно анализировать прогрессирование бай и связанные ячейки проникновение в одном эмбрионов с течением времени, мы использовали файл проекта «Данио рерио-Immunotest», который функционирует в рамках «ObjectJ» (плагин для ImageJ) для количественного определения интенсивности флуоресценции бактерии проживающих и макрофагов, внедряясь в непосредственной близости от укола микросферы33. Кроме того, мы определили число колонии формирование единиц (CFU) бактерий в присутствии и отсутствии микросфер в эмбрионы для изучения потенциальных последствий биоматериалов на инфекции. Наше настоящее исследование демонстрирует, что с помощью методов, разработанных здесь, zebrafish эмбриона является многообещающим, Роман позвоночных животных модель для изучения биоматериал ассоциированных инфекций в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Биоматериал ассоциированной инфекции (бай) является серьезным осложнением клинических. Лучшего понимания патогенеза бай в естественных условиях обеспечит новые идеи для улучшения профилактики и лечения бай. Однако текущие экспериментальные бай Животные модели таких мышиных моделях…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было финансовой поддержке проекта Ибица биомедицинских материалов (BMM) программы и совместно финансируется министерства экономических дел Нидерландов. Авторы хотели бы поблагодарить Проф д-р Грэм Lieschke из университета Монаш, Австралия за предоставление трансгенные линии данио рерио (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
Riferimenti
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
- Otto, M. Staphylococcus epidermidis – the ‘accidental’ pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
- Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
- Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
- Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
- Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
- Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
- Darouiche, R. O. Current concepts – Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
- Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
- Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W., Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. , 307-354 (2013).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
- Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
- van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
- Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
- Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
- Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
- Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
- Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -. V., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. , 7-37 (2002).
- Chaplin, W. T. P. . Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , (2017).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
- Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
- Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
- Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
- Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).
