Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados Staphylococcus aureus infección
Summary
El presente estudio describe un modelo de embrión de pez cebra para visualización in vivo y análisis intravital de infecciones asociadas a biomateriales en el tiempo basado en microscopía de fluorescencia. Este modelo es un sistema prometedor complementando modelos animales mamíferos como los modelos de ratón para el estudio de las infecciones asociadas a biomateriales en vivo.
Abstract
Infecciones asociadas a biomateriales (BAI) es una causa importante del fracaso de los dispositivos médicos y biomateriales. Staphylococcus aureus es uno de los principales patógenos en BAI. Animal mamífero del BAI experimental actual modelos como modelos de ratón son costosos y desperdiciadores de tiempo y por lo tanto no es adecuado para el análisis de alto rendimiento. Por lo tanto, se desean que los nuevos modelos animales como sistemas complementarios para la investigación de BAI en vivo. En el presente estudio, el objetivo fue desarrollar un modelo de embrión de pez cebra para visualización in vivo y análisis intravital de infección bacteriana en presencia de biomateriales basados en la microscopía de fluorescencia. Además, se estudió la respuesta de macrófagos provocada. Para ello, utilizan fluorescentes expresando proteína de S. aureus y embriones de pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes en los macrófagos y desarrolló un procedimiento para inyectar bacterias solas o junto con microesferas en el músculo tejido de embriones. Para supervisar la progresión de la infección bacteriana en embriones vivos con el tiempo, ideamos un método simple pero confiable de puntuación microscópica de bacterias fluorescentes. Los resultados de puntuación microscópica demostraron que todos los embriones con más de 20 unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias dio como resultado una señal fluorescente positiva de las bacterias. Para estudiar los posibles efectos de los biomateriales en la infección, se determinó el número de UFC de S. aureus con y sin 10 μm microesferas de poliestireno (PS10) como biomateriales de modelo en los embriones. Por otra parte, se utilizó el archivo de proyecto ObjectJ “Pez cebra-Immunotest” en ImageJ para cuantificar la intensidad de fluorescencia de la infección de S. aureus con y sin PS10 con el tiempo. Resultados de ambos métodos mostraron mayor números de S. aureus en los embriones infectados con microesferas que en embriones sin microesferas, que indica una susceptibilidad creciente de la infección en presencia de biomaterial. Así, el presente estudio muestra el potencial del modelo de embrión de pez cebra para estudiar BAI con los métodos desarrollados aquí.
Introduction
Una variedad de dispositivos médicos (que se refiere como “biomateriales”) se utilizan cada vez más en la medicina moderna para restaurar o reemplazar partes del cuerpo humano1. Sin embargo, la implantación de biomateriales predispone a un paciente a la infección, llamada una infecciones asociadas a biomateriales (BAI), que es una importante complicación de implantes en cirugía. Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis son dos especies bacterianas más frecuentes responsables de BAI2,3,4,5,6. Implantado de forma de biomateriales una superficie susceptible a la formación de biopelículas bacterianas. Por otra parte, respuesta inmune local puede ser trastornada por los biomateriales implantados, que reducirá la eficacia de remoción bacteriana. La separación inicial de infectar a las bacterias se realiza principalmente por infiltración de neutrófilos, que han fuertemente reducido capacidad bactericida en presencia de un insertado o implantan biomaterial7. Por otra parte, los macrófagos que infiltran el tejido después de la llegada inicial de neutrófilos a fagocitar las bacterias restantes pero no efectivamente matan intracelularmente, por desquiciados inmune señalando que es una consecuencia de la presencia combinada de el biomaterial y bacterias8. Así, la presencia de biomateriales puede facilitar la supervivencia intracelular de bacterias9,10,11,12,13 y biofilm formación en los implantados Biomateriales4,14. En consecuencia, BAI puede llevar a la insuficiencia y necesidad de reemplazo de biomateriales implantados, causando aumento de la morbilidad y la mortalidad y la hospitalización prolongada con costes adicionales2,15.
Un número creciente de estrategias anti-BAI está siendo desarrollados2,16,17. Evaluación in vivo de la eficacia de estas estrategias en los modelos animales relevantes es esencial. Sin embargo, tradicional BAI animales modelos experimentales (e.g. modelos del ratón de, ) son generalmente costosos, desperdiciadores de tiempo y por lo tanto no es adecuado para las pruebas de alto rendimiento de múltiples estrategias18. Desarrollo reciente de técnicas de imagen bio-óptico basado en etiquetado fluorescente bioluminiscente de las bacterias y las células del huésped puede permitir el monitoreo continuo de las interacciones de progresión y huésped-patógeno-host-material BAI en solo animales pequeños como ratones18,19,20,21. Sin embargo, esta técnica es relativamente compleja y aún en su infancia, y se deben abordar varios temas para el análisis cuantitativo de BAI18. Por ejemplo, una dosis de desafío alta es necesaria para visualizar la colonización bacteriana. Además, la luz dispersa y adsorción de bioluminiscencia/fluorescencia señales en tejidos de mamífero prueba animales también deben ser abordados18,19,21. Por lo tanto, modelos animales novedosos y rentables permitiendo la visualización intravital y análisis cuantitativo en el tiempo son valiosos sistemas complementarios para el estudio in vivo de BAI.
Pez cebra (embriones) se han utilizado como una herramienta versátil en vivo para disección huésped-patógeno y patogenia de la infección de varias especies bacterianas como micobacterias22, aeruginosa de los Pseudomonas23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25y estafilococos26,27. Embriones de pez cebra tienen muchas ventajas tales como transparencia óptica, un relativamente bajo coste de mantenimiento y de posesión de un sistema inmune muy similar a la de mamíferos28,29. Esto hace que los embriones de pez cebra un organismo modelo muy económico, vivir para intravital visualización y análisis de la progresión de la infección y host asociado respuestas28,29. Para permitir la visualización del comportamiento de la célula líneas de pez cebra transgénico, en vivo con diferentes tipos de células inmunes (por ejemplo,, los macrófagos y neutrófilos) e incluso con estructuras subcelulares fluorescencia de etiquetado han sido desarrollado28 ,29. Además, la tasa alta de reproducción del pez cebra ofrece la posibilidad de desarrollar sistemas de prueba de alto rendimiento con inyección robótica automatizada, cuantificación de fluorescencia automatizada y RNA secuencia análisis27, 30.
En el presente estudio, el objetivo fue desarrollar un modelo de embrión de pez cebra para infecciones asociadas a biomateriales usando técnicas de imágenes de fluorescencia. Para ello, hemos desarrollado un procedimiento para inyectar bacterias (S. aureus) en presencia de microesferas de biomaterial en el tejido muscular de los embriones de pez cebra. Utilizamos S. aureus RN4220 expresando mCherry proteína fluorescente (S. aureus– mCherry), que fue construida como se describe en otra parte de otra cepa de S. aureus 10,31. La línea de pez cebra transgénico (mpeg1: UAS/Kaede) expresando Kaede se utilizaron proteína verde fluorescente en los macrófagos32 y azul fluorescente poliestireno microesferas. En un estudio previo, hemos demostrado que la inyección intramuscular de microesferas en embriones de pez cebra para imitar la implantación del biomaterial es factible33. Para analizar cuantitativamente la progresión de BAI y la infiltración de la célula asociada en embriones solo con el tiempo, se utilizó el archivo de proyecto “Pez cebra-Immunotest” que funciona dentro de “ObjectJ” (un plug-in para ImageJ) para cuantificar la intensidad de fluorescencia de las bacterias que residen y macrófagos infiltración en las cercanías del sitio de la inyección de microesferas33. Además, se determinó el número de la Colonia formando unidades (UFC) de bacterias en presencia y ausencia de microesferas en los embriones para estudiar posibles efectos de los biomateriales en la infección. El presente estudio demuestra que con los métodos desarrollados aquí, el embrión de pez cebra es un prometedor novela vertebrado animal modelo para el estudio de las infecciones asociadas a biomateriales en vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Infecciones asociadas a biomateriales (BAI) es una complicación clínica grave. Una mejor comprensión de la patogenesia del BAI en vivo ofrecería nuevas ideas para mejorar la prevención y tratamiento de BAI. Sin embargo, experimental BAI animales modelos actuales como modelos murinos son costosos, que requieren mucho trabajo y requieren personal especializado entrenado en las técnicas quirúrgicas complejas. Por lo tanto, estos modelos no son adecuados para el análisis de alto rendimiento. Requisitos para modelos d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el proyecto de IBIZA del programa biomédico Material (BMM) financieramente y cofinanciado por el Ministerio holandés de asuntos económicos. Los autores desean agradecer Prof. Dr. Graham Lieschke de Monash University, Australia para proporcionar la línea de pez cebra transgénico (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
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