Un modèle d’embryon de poisson zèbre pour In Vivo visualisation et analyse Intravitale du biomatériau associée à Staphylococcus aureus Infection
Summary
La présente étude décrit un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection associée aux biomatériaux au fil du temps basée sur la microscopie de fluorescence. Ce modèle est un système prometteur en complément des modèles animaux mammifères tels que les modèles de souris pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.
Abstract
Infection associée aux biomatériaux (BAI) est des principales causes de l’échec de biomatériaux/appareils médicaux. Staphylococcus aureus est l’un des principaux pathogènes en BAI. Cours expérimentales animales mammifères de BAI modèles tels que les modèles murins sont coûteuses et chronophages et donc pas adapté à l’analyse à haut débit. Ainsi, les nouveaux modèles animaux comme des systèmes complémentaires pour enquêter sur les BAI in vivo sont souhaitées. Dans la présente étude, nous avons cherché à développer un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection bactérienne en présence de biomatériaux basés sur la microscopie de fluorescence. En outre, la réponse provoquée macrophage a été étudiée. À cette fin, nous avons utilisé fluorescent protéine exprimant S. aureus et embryons de poisson-zèbre transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les macrophages et mis au point une procédure pour injecter des bactéries, seuls ou avec des microsphères dans le muscle tissus d’embryons. Pour suivre l’évolution de l’infection bactérienne chez les embryons vivants au fil du temps, nous avons conçu une méthode simple mais fiable de la notation microscopique de bactéries fluorescentes. Les résultats de marquer microscopiques ont montré que tous les embryons avec plus de 20 unités formant colonie (UFC) de bactéries a donné un signal positif fluorescent de bactéries. Afin d’étudier les effets potentiels des biomatériaux sur infection, nous avons déterminé le nombre d’UFC de S. aureus avec et sans des microsphères de polystyrène 10 µm (PS10) comme les biomatériaux de modèle chez les embryons. En outre, nous avons utilisé le fichier de projet ObjectJ « Poisson-zèbre-Immunotest » opérant dans ImageJ pour quantifier l’intensité de la fluorescence de l’infection à Staphylococcus aureus avec et sans PS10 au fil du temps. Les résultats de ces deux méthodes ont montré un nombre plus élevé de S. aureus dans des embryons infectés avec microsphères que chez les embryons sans microsphères, indiquant une susceptibilité accrue d’infection en présence de ce biomatériau. Ainsi, cette étude montre le potentiel du modèle embryon de poisson zèbre pour étudier BAI avec les méthodes développées ici.
Introduction
Une variété de dispositifs médicaux (dénommé « biomatériaux ») sont plus utilisés dans la médecine moderne à restaurer ou remplacer des parties de corps humain1. Toutefois, l’implantation des biomatériaux prédispose un patient à l’infection, appelée une infection associée aux biomatériaux (BAI), qui est une complication majeure des implants en chirurgie. Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis sont deux espèces de bactéries plus répandus responsables de BAI2,3,4,5,6. Implanté à forme de biomatériaux une surface sensible à la formation de biofilm bactérien. En outre, réponse immunitaire locale peut être dérangée par les biomatériaux implantés, causant une efficacité réduite de clairance bactérienne. Le dégagement initial d’infectant des bactéries est effectué principalement par infiltration de neutrophiles, qui ont fortement réduit la capacité bactéricide en présence d’inséré ou un biomatériau7. En outre, macrophages s’infiltrer dans les tissus après que l’afflux initial de neutrophiles vont phagocyter les bactéries restantes, mais ne peuvent pas efficacement les tueront intracellulaire, en raison de dérangé immunitaire de signalisation qui est une conséquence de la présence combinée de le biomatériau et bactéries8. Ainsi, la présence des biomatériaux peut faciliter la survie intracellulaire des bactéries9,10,11,12,13 et biofilm formation sur l’implant biomatériaux,4,14. Par conséquent, BAI peut conduire à l’échec et nécessaire pour le remplacement des biomatériaux implantables, causant une augmentation de la morbidité et de mortalité et d’hospitalisation prolongée avec des coûts supplémentaires2,15.
Un nombre croissant de stratégies anti-BAI est actuellement développés2,16,17. Évaluation in vivo de l’efficacité de ces stratégies dans des modèles animaux pertinents est essentielle. Cependant, les traditionnels modèles animaux expérimentaux de la BAI (p. ex., les modèles de souris, ) sont généralement coûteux, chronophages et donc ne convient pas pour le haut débit test de multiples stratégies18. Développement récent des techniques d’imagerie bio-optique basé sur bioluminescent/fluorescent étiquetage des bactéries et des cellules de l’hôte peut permettre la surveillance continue des interactions de progression et hôte-pathogène-matériel/hôte BAI en simples petits animaux comme les souris18,19,20,21. Cependant, cette technique est relativement complexe et encore à ses balbutiements, et plusieurs questions doivent être traitées pour l’analyse quantitative de BAI18. Par exemple, une dose de provocation élevée est nécessaire pour visualiser la colonisation bactérienne. En outre, la lumière diffusion et adsorption des signaux de bioluminescence/fluorescence dans les tissus des essais chez les mammifères, les animaux doivent être également adressée à18,19,21. Par conséquent, des modèles animaux innovatrice et rentables permettant une visualisation intravitale et analyse quantitative au fil du temps sont des systèmes complémentaires utiles pour l’étude in vivo de BAI.
Poisson-zèbre (embryons) ont servi comme un outil polyvalent in vivo pour disséquer les interactions hôte-pathogène et la pathogenèse de l’infection de plusieurs espèces de bactéries telles que les mycobactéries22, Pseudomonas aeruginosa,23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25et staphylocoques26,27. Des embryons de poisson-zèbre présentent de nombreux avantages tels que la transparence optique, un coût d’entretien relativement faible et la possession d’un système immunitaire très semblable à celui des mammifères28,29. Cela rend les embryons de poisson-zèbre, un organisme modèle très économique, vivant pour intravitale visualisation et l’analyse de la progression de l’infection et hôtes réponses28,29. Pour permettre la visualisation du comportement de la cellule zebrafish in vivo, transgénique lignes avec différents types de cellules immunitaires (par exemple, les, macrophages et les neutrophiles) et même avec des structures subcellulaires fluorescent marqués ont été mis au point28 ,29. En outre, le taux de reproduction élevé du poisson-zèbre offre la possibilité de développer des systèmes de test haut débit avec injection robotique automatisée, quantification de fluorescence automatisé et RNA sequence analysis27, 30.
Dans la présente étude, nous avons cherché à développer un modèle d’embryon de poisson zèbre pour infection associée aux biomatériaux à l’aide de techniques d’imagerie de fluorescence. À cette fin, nous avons développé une procédure pour injecter des bactéries (Staphylococcus aureus) en présence de microsphères de biomatériau dans le tissu musculaire des embryons de poisson-zèbre. Nous avons utilisé des S. aureus RN4220 exprimant mCherry protéine fluorescente (s. aureus– mCherry), qui a été construite comme ailleurs pour un autre S. aureus souche10,31. La ligne zebrafish transgénique (mpeg1 : SAMU/Kaede) exprimant Kaede protéine fluorescente verte dans les macrophages32 et bleu fluorescent des microsphères de polystyrène ont été utilisés. Dans une étude précédente, nous avons montré qu’une injection intramusculaire de microsphères dans des embryons de poisson-zèbre pour imiter l’implantation biomatériau est faisable33. Quantitativement, analyser la progression de BAI et l’infiltration de cellules associées chez les embryons unique au fil du temps, nous avons utilisé le fichier de projet de « Poisson-zèbre-Immunotest » qui est utilisé dans un « ObjectJ » (un plug-in pour ImageJ) pour quantifier l’intensité de la fluorescence de les bactéries résidant et macrophages infiltrant à proximité du site d’injection de microsphères33. En outre, nous avons déterminé les numéros formant des colonies (UFC) d’unités de bactéries en présence et en absence des microsphères dans les embryons d’étudier les effets potentiels des biomatériaux sur l’infection. Notre étude montre qu’avec les méthodes développées ici, l’embryon de poisson zèbre est un modèle animal vertébré prometteur, roman pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Infection associée aux biomatériaux (BAI) est une complication grave de clinique. Une meilleure compréhension de la pathogenèse de BAI in vivo pourrait apporter un nouvel éclairage pour améliorer la prévention et le traitement de BAI. Cependant, actuel BAI des modèles animaux expérimentaux tels que les modèles murins sont coûteuses et fastidieuses et nécessitent un personnel spécialisé formés aux techniques chirurgicales complexes. Par conséquent, ces modèles ne conviennent pas pour analyse à haut débi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financièrement soutenue par le projet d’IBIZA du programme matériel biomédical (BMM) et cofinancée par le ministère néerlandais des affaires économiques. Les auteurs souhaite remercier Prof. Dr. Graham Lieschke de l’Université Monash en Australie pour fournir la lignée transgénique de poisson-zèbre (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
Riferimenti
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
- Otto, M. Staphylococcus epidermidis – the ‘accidental’ pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
- Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
- Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
- Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
- Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
- Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
- Darouiche, R. O. Current concepts – Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
- Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
- Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W., Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. , 307-354 (2013).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
- Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
- van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
- Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
- Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
- Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
- Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
- Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -. V., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. , 7-37 (2002).
- Chaplin, W. T. P. . Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , (2017).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
- Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
- Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
- Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
- Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).
