Zebrafish 태아 모델 Vivo 시각화 및 Intravital 소재 분석 관련 된 황색 포도상구균 에 감염
Summary
현재 학문 vivo에서 시각화 및 형광 현미경 검사 법에 따라 시간이 지나면 소재 관련 감염의 intravital 분석을 위한 zebrafish 태아 모델을 설명 합니다. 이 모델은 소재 관련 감염 vivo에서 공부에 대 한 마우스 모델 같은 포유류 동물 모델을 보완 하는 유망한 시스템.
Abstract
소재 관련 감염 (바이) 바이오/의료 장치 실패의 주요 원인입니다. 황색 포도상구균 바이에 주요 병원 중 하나입니다. 현재 실험 바이 포유류 동물 모델 같은 마우스 모델은 비용이 많이 드는 고 어렵고, 따라서 높은 처리량 분석에 적합 하지 않은. 따라서, 바이 vivo에서 조사에 대 한 보완 시스템으로 새로운 동물 모델 원하는 됩니다. 현재의에서 연구, vivo에서 시각화 및 형광 현미경 검사 법에 따라 생체의 세균성 감염의 intravital 분석을 위한 zebrafish 태아 모델을 개발 하는 목적으로 우리. 또한, 만들었다 대 식 세포 반응 연구 했다. 이 위해, 우리는 형광 단백질을 표현 S. 구 균 및 그들의 세포에서 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 zebrafish 태아를 사용 하 고 근육에 혼자 또는 스피어 함께 박테리아를 주입 하는 절차를 개발 태아 조직 시간이 지남에 라이브 배아에서 세균 감염 진행을 모니터링 하려면 우리는 형광 박테리아의 미세한 득점의 간단 하지만 신뢰할 수 있는 방법을 고안. 미세한 점수에서 결과 20 이상 식민지 형성 단위 (CFU) 박테리아의 모든 배아 박테리아의 긍정적인 형광 신호를 굴복 했다. 감염에 생체의 잠재적인 효과 연구, 우리는 결정 S. 구 균 의 CFU 숫자와 10 μ m의 폴리스 티 렌 스피어 (PS10) 없이 배아 생체 재료 모델. 또한, 우리 시간이 지남에 PS10 없이 S. 구 균 감염의 형광 강도 계량 ObjectJ 프로젝트 파일 “제 브라-Immunotest” ImageJ에서 사용. 두 방법의 결과 보다는 소재에 존재 증가 감염 민감성을 나타내는 스피어 없이 배아에 스피어와 감염 된 태아 S. 구 균 수가 보였다. 따라서, 현재 연구 여기 개발 방법으로 바이 공부 zebrafish 태아 모델의 잠재력을 보여줍니다.
Introduction
다양 한 의료 기기 (“바이오” 라고도 함) 점점을 복원 하거나 인체 부품1현대 의학에서 사용 하 고 있습니다. 그러나, 생체 이식 감염, 불리는 소재 관련 감염 (바이), 임 플 란 트 수술에서의 주요 합병증에 환자를 걸리기. 포도 상 구 균 그리고 포도 상 구 균 epidermidis 두 개의 가장 널리 퍼진 세균 종 바이2,,34,,56에 대 한 책임입니다. 이식 생체 재료 형태 표면 세균의 biofilm 형성에 취약 합니다. 또한, 로컬 면역 반응은 일으키는 세균성 클리어런스의 감소 효과 이식된 생체 재료에 의해 미친 수 있습니다. 박테리아 감염의 초기 허가 강하게 존재는 삽입 된 살 균 용량 감소 또는 이식 소재7호 중구 침투에 의해 주로 수행 됩니다. 또한, 후에 호 중구의 초기 유입 나머지 박테리아 phagocytose 것 있지만 수 없습니다 효과적으로 조직에 침투 하는 세포 그들을 죽 일 침,의 결합 된 존재의 결과 이다 미친된 면역 신호 때문 소재 및 박테리아8. 따라서, 생체 재료의 존재는 박테리아9,10,11,12,13 , biofilm 형성에는 이식의 세포내 생존을 촉진할 수 있다 바이오4,14. 따라서, 바이 실패 이어질 수 있으며 추가 비용2,15증가 병 적 상태와 사망률과 장기 입원을 일으키는 이식된 생체 재료의 교체에 대 한 필요.
개발된2,,1617안티 바이 전략의 수가 증가 되. 이러한 전략 관련 동물 모델에서의 효능의 vivo에서 평가 필수적 이다. 그러나, 전통적인 실험적인 바이 동물 모델 (예:, 마우스 모델)은 일반적으로 비용이 많이 드는, 어렵고, 따라서 여러 전략18의 높은 처리량 테스트에 적합 하지 않은. 발광/형광 호스트 세포와 박테리아의 라벨에 따라 바이오 광 이미징 기술의 최근 발전 한 작은 동물에서 바이 진행 및 호스트 재료 호스트 병원 체 상호 작용의 지속적인 모니터링에 대 한 수 있습니다. 같은 쥐18,19,,2021. 그러나,이 기술은 상대적으로 복잡 하 고, 그것의 초기 단계에 아직도 이며 바이18의 정량 분석에 대 한 몇 가지 문제를 해결 해야 합니다. 예를 들어, 높은 도전 복용량은 세균성 식민지를 시각화 해야 합니다. 또한, 비 산 빛을 생물 발광/형광 신호 포유류 테스트 또한 있어야 동물의 조직에의 흡착 처리18,,1921. 따라서, 소설, 시간이 지남에 intravital 시각화 및 정량 분석에 허용 된 동물 모델에는 바이 vivo에서 공부에 대 한 귀중 한 보완 시스템입니다.
Zebrafish (배아) 호스트 병원 체 상호 작용 및 mycobacteria22, 녹 농 균23, 등 여러 가지 세균의 감염 병 인을 해 부에 대 한 다양 한 생체 조건 도구로 사용 되었습니다. 대장균24, Enterococcus faecalis25, 그리고 포도 상 구 균,2627. Zebrafish 태아 광학 투명도, 상대적으로 낮은 유지 보수 비용, 및 포유류28,29에 매우 비슷한 면역 시스템의 같은 많은 이점이 있다. 이로써 zebrafish 태아 intravital 시각화 및 감염 진행과 관련 된 호스트 응답28,29의 분석에 매우 경제, 생활 모형 유기 체. 셀 동작의 시각화 vivo에서, 유전자 변형 zebrafish 라인 (예:, 대 식 세포와 호 중구) 면역 세포의 종류와 고도 붙일 태그가 subcellular 구조 되었습니다28 개발 29. 또한, zebrafish의 높은 복제 율 높은 처리량 테스트 시스템 자동화 로봇 주입, 자동된 형광 정량화, 그리고 RNA 순서 분석27, 을 개발의 가능성을 제공 30.
현재 연구에 우리 형광 이미징 기술을 사용 하 여 소재 관련 감염을 위한 zebrafish 태아 모델 개발을 목적으로. 이 위해, 우리 zebrafish 태아의 근육 조직으로 소재 스피어의 박테리아 (S. 구 균)을 주입 하는 절차를 개발. S. 구 균 RN4220 표현 mCherry 형광 단백질 (균 S.-mCherry), 다른 미 균 스트레인10,31에 대 한 설명 되어 있는 대로 만들어진 사용 했습니다. 유전자 변형 zebrafish 라인 (mpeg1: UAS/단풍나무) 표현 하는 데 녹색 형광 단백질은 세포32 와 파란색 형광 폴리스 티 렌 스피어에 사용 되었다. 이전 연구에서 우리가 모방 소재 이식 zebrafish 태아에 스피어의 근육 주사 가능33는 것으로 나타났습니다. 바이의 진행과 시간이 지남에 단일 배아에 관련 된 세포 침투 양적 분석을 사용 하는 척도의 형광 강도를 “ObjectJ” (플러그인 ImageJ) 내에서 운영 되는 “제 브라-Immunotest” 프로젝트 파일 있는 박테리아 그리고 세포 침투 하는 스피어33의 사출 사이트 주변. 또한, 우리는 식민지 형성의 숫자를 결정 단위의 (CFU) 존재와 배아에 스피어의 부재에 박테리아 감염에 생체의 잠재적인 효과 공부 하. 우리의 현재 연구는 여기 개발 방법, zebrafish 태아는 소재 관련 감염 vivo에서 공부에 대 한 약속, 소설 척추 동물 모델을 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
소재 관련 감염 (바이) 심각한 임상 합병증 이다. Vivo에서 바이의 pathogenesis의 이해 바이의 치료와 예방을 개선 하기 위해 새로운 통찰력을 제공할 것 이다. 그러나, murine 모델 현재 바이 동물 모델 실험 비용, 노동 집약적인, 그리고 복잡 한 수술 기술 전문된 인력 훈련 필요. 따라서, 이러한 모델 높은 처리량 분석에 적합 하지 않습니다. 현재 연구 평가 여부 zebrafish 태아 바이 vivo에서, 보완 조사 소?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구 재정적으로 생물 소재 (BMM) 프로그램의이 비자 프로젝트에 의해 지원 되었고 네덜란드 경제부의 공동 자금. 저자 교수 박사 그레이엄 Lieschke 모나 쉬 대학, 호주에서 zebrafish 유전자 변형 라인을 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다 (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
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