Zebrafisk Embryo Model for In Vivo visualisering og Intravital analyse af biomateriale-associerede Staphylococcus aureus infektion
Summary
Den nuværende undersøgelse beskriver en zebrafisk embryo model for in vivo visualisering og intravital analyse af biomateriale-associerede infektion over tid baseret på Fluorescens mikroskopi. Denne model er en lovende system som supplement til pattedyr dyremodeller såsom musemodeller for at studere biomateriale-associerede infektioner in vivo.
Abstract
Biomateriale-associerede infektion (BAI) er en væsentlig årsag til svigt af biomaterialer/medicinsk udstyr. Staphylococcus aureus er en af de store patogener i BAI. Nuværende eksperimentelle BAI pattedyr dyre modeller såsom musemodeller er dyrt og tidskrævende, og derfor ikke velegnet til høje overførselshastighed analyse. Således er er romanen dyremodeller som komplementære systemer for at undersøge BAI in vivo ønsket. I nuværende undersøgelse, vi har til formål at udvikle en zebrafisk embryo model for in vivo visualisering og intravital analyse af bakteriel infektion i overværelse af biomaterialer baseret på Fluorescens mikroskopi. Derudover blev provokeret makrofag svar studeret. Til dette formål, vi anvendte fluorescerende proteiner-udtrykker S. aureus og transgene zebrafisk embryoner udtrykker fluorescerende proteiner i deres makrofager og udviklet en procedure for at injicere bakterier alene eller sammen med mikrokugler i musklen væv af embryoner. For at overvåge bakterieinfektion progression i levende embryoner over tid, udtænkt vi en enkel, men pålidelig metode til mikroskopiske scoring af fluorescerende bakterier. Resultater fra mikroskopiske scoring viste, at alle embryoner med mere end 20 kolonidannende enheder (CFU) af bakterier viste en positiv fluorescerende signal af bakterier. For at undersøge de potentielle virkninger af biomaterialer på infektion, besluttet vi CFU numre af S. aureus med og uden 10 µm polystyren mikrokugler (PS10) som model biomaterialer i embryoner. Desuden brugte vi ObjectJ-projektfil “Zebrafisk-Immunotest” opererer i ImageJ for at kvantificere fluorescens-intensiteten af S. aureus infektion med og uden PS10 over tid. Resultaterne fra begge metoder viste højere numre af S. aureus i smittede fostre med mikrokugler end i embryoner uden mikrokugler, som angiver en øget infektion modtagelighed i nærværelse af biomateriale. Således, den nuværende undersøgelse viser potentiale af zebrafisk embryo model til at studere BAI med de metoder, der er udviklet her.
Introduction
En bred vifte af medicinsk udstyr (benævnt “biomaterialer”) bruges i stigende i moderne medicin til at genoprette eller erstatte menneskelige legeme dele1. Dog disponerer implantation af biomaterialer en patient til infektion, kaldet en biomateriale-associerede infektion (BAI), som er en væsentlig komplikation af implantater i kirurgi. Staphylococcus aureus og Staphylococcus epidermidis er to mest udbredte bakteriearter, der er ansvarlig for BAI2,3,4,5,6. Implanteret biomaterialer form en overflade, der er modtagelige for bakterielle Biofilmdannelse. Desuden kan lokale immunrespons gale af de implanterede biomaterialer, forårsager reduceret effektiviteten af bakteriel clearance. Indledende regnskabsafslutning inficerer bakterier udføres hovedsagelig af infiltrerer neutrofiler, som kraftigt har reduceret baktericide kapacitet i overværelse af en indsat eller implanteret biomateriale7. Derudover dræbe makrofager infiltrerer vævet, efter den indledende tilstrømning af neutrofiler vil phagocytosis de resterende bakterier men ikke kan effektivt dem intracellulært, på grund af sindssyge immun signalering, som er en konsekvens af den kombinerede tilstedeværelsen af den biomateriale og bakterier8. Således er kan tilstedeværelsen af biomaterialer lette intracellulære overlevelse af bakterier9,10,11,12,13 og biofilm dannelse på den indopererede biomaterialer4,14. Derfor kan BAI føre til fiasko og behovet for udskiftning af implanterede biomaterialer, forårsager øget sygelighed og dødelighed og langvarig indlæggelse med meromkostninger2,15.
Et stigende antal anti-BAI strategier er ved at blive udviklet2,16,17. In vivo evaluering af effekten af disse strategier i relevante dyremodeller er afgørende. Traditionelle eksperimentelle BAI dyremodeller (f.eks., musemodeller) er dog normalt dyrt, tidskrævende og derfor ikke velegnet til høje overførselshastighed afprøvning af flere strategier18. Seneste udvikling af bio-optiske billeddannelse teknikker baseret på en bioluminescerende/fluorescerende mærkning af værtsceller og bakterier kan tillade til kontinuerlig overvågning af BAI progression og vært-patogen/host-materiale interaktioner i enkelt lille dyr f.eks mus18,19,20,21. Dog, denne teknik er relativt komplekse og stadig i sin vorden, og flere problemer skal løses til kvantitativ analyse af BAI18. For eksempel, er en høj udfordring dosis forpligtet til at visualisere bakteriel kolonisering. Derudover lys spredning og adsorptionen af bioluminescens/fluorescens signaler i væv af pattedyr test dyr skal også være rettet18,19,21. Derfor, roman, omkostningseffektive dyremodeller giver mulighed for intravital visualisering og kvantitativ analyse over tid er værdifuld supplerende systemer for at studere BAI in vivo.
Zebrafisk (embryoner) har været brugt som en alsidig in vivo redskab til dissekere vært-patogen interaktioner og infektion patogenesen af flere bakteriearter mykobakterier22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25og stafylokokker26,27. Zebrafisk embryoner har mange fordele som optisk gennemsigtighed, en relativt lav vedligeholdelsesomkostninger og besiddelse af en immun ordning meget lig den i pattedyr28,29. Dette gør zebrafisk embryoner en meget økonomisk, levende model organisme for intravital visualisering og analyse af infektion progression og tilknyttede vært svar28,29. At tillade visualisering af celle behavior in vivo, transgene zebrafisk linjer med forskellige typer af immunceller (f.eks., makrofager og neutrofiler) og endda med fluorescently mærket subcellulært strukturer har været udviklet28 ,29. Desuden giver høj reproduktion sats af zebrafisk mulighed for at udvikle høj overførselshastighed testsystemer byder automatiseret robot injektion, automatiseret fluorescens kvantificering og RNA sekvens analyse27, 30.
I den foreliggende undersøgelse, vi har til formål at udvikle en zebrafisk embryo model for biomateriale-associerede infektion ved hjælp af fluorescens Billeddannende teknikker. Med henblik herpå udviklet vi en procedure for at injicere bakterier (S. aureus) i nærværelse af biomateriale mikrokugler ind i muskelvævet zebrafisk embryoner. Vi brugte S. aureus RN4220 udtrykker mCherry fluorescerende proteiner (S. aureus– mCherry), som blev bygget som beskrevet andetsteds for en anden S. aureus stamme10,31. Linjen transgene zebrafisk (mpeg1: UAS/Kaede) udtrykker Kaede grøn fluorescerende proteiner i den makrofager32 og blå fluorescerende polystyren mikrokugler blev brugt. I en tidligere undersøgelse, har vi vist, at intramuskulær injektion af mikrokugler i zebrafisk embryoner til at efterligne biomateriale implantation er muligt33. For at analysere kvantitativt progression af BAI og tilknyttede celle infiltration i enkelt embryoner over tid, brugte vi projektfilen “Zebrafisk-Immunotest”, der drives inden for “ObjectJ” (et plug-in for ImageJ) at kvantificere fluorescens-intensiteten af bakterier har bopæl og makrofager infiltrerer omkring injektionsstedet mikrokugler33. Derudover vi bestemmes antallet af kolonidannende enheder (CFU) af bakterier i tilstedeværelse og fravær af mikrokugler i embryoner til at studere potentielle effekter af biomaterialer på infektion. Vores nuværende undersøgelse viser, at med de metoder, der udvikles her, zebrafisk embryoet er en lovende, Roman hvirveldyr dyremodeller for at studere biomateriale-associerede infektioner in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biomateriale-associerede infektion (BAI) er en alvorlig klinisk komplikation. Forståelsen af patogenesen af BAI in vivo ville give ny indsigt for at forbedre forebyggelse og behandling af BAI. Dog aktuelle eksperimentelle BAI dyremodeller såsom murine modeller er dyre, arbejdskrævende og kræver specialiseret personale uddannet i komplekse kirurgiske teknikker. Disse modeller er derfor ikke egnet til høj overførselshastighed analyse. Da kravene for zebrafisk embryo modeller er mindre komplekse og omkostninger genere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev økonomisk støttet af biomedicinske materiale (BMM) programmet IBIZA projekt og medfi nansieret af den hollandske økonomiministerium. Forfatterne vil gerne takke Prof. Dr. Graham Lieschke fra Monash Universitet i Australien for at give zebrafisk transgene linje (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
Riferimenti
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
- Otto, M. Staphylococcus epidermidis – the ‘accidental’ pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
- Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
- Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
- Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
- Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
- Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
- Darouiche, R. O. Current concepts – Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
- Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
- Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W., Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. , 307-354 (2013).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
- Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
- van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
- Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
- Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
- Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
- Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
- Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -. V., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. , 7-37 (2002).
- Chaplin, W. T. P. . Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , (2017).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
- Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
- Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
- Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
- Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).
