Automatiseret billedbaseret kvantificering af neutrofile ekstracellulære fælder med NETQUANT
Summary
Her præsenterer vi en protokol til generering af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) og operativ NETQUANT, en fuldautomatisk software option til kvantificering af net i immunofluorescens billeder.
Abstract
Neutrofile ekstrellulære fælder (NETs) er web-lignende antimikrobielle strukturer bestående af DNA og granulat afledte antimikrobielle proteiner. Immunofluorescens mikroskopi og billedbaserede kvantificeringsmetoder er fortsat vigtige værktøjer til kvantificering af neutrofile ekstracellulær fælde dannelse. Der er imidlertid væsentlige begrænsninger for immunofluorescens baserede metoder, som i øjeblikket er tilgængelige for kvantificering af garn. Manuelle metoder til billedbaseret netto kvantificering er ofte subjektive, tilbøjelige til at fejl og kedelig for brugere, især ikke-erfarne brugere. Også, i øjeblikket tilgængelige software muligheder for kvantificering er enten semi-automatiske eller kræver uddannelse før drift. Her viser vi implementeringen af en automatiseret immunofluorescence-baseret billed kvantificerings metode til at evaluere netto dannelsen kaldet NETQUANT. Softwaren er nem at bruge og har en brugervenlig grafisk brugergrænseflade (GUI). Det betragter biologisk relevante parametre såsom en stigning i overfladearealet og DNA: netto markør protein ratio, og nuklear deformation at definere netto dannelse. Desuden er dette værktøj er bygget som en frit tilgængelig app, og giver mulighed for enkelt-celle opløsning kvantificering og analyse.
Introduction
Neutrofiler er afgørende mediatorer af medfødte vært forsvar svar mod en bred vifte af mikrobielle patogener1. De udfører deres antimikrobielle funktioner ved at frigive deres granulat, der indeholder en bred vifte af antimikrobielle proteiner2, producerer reaktive ilt arter (ros) og hypochlorit1, og gennem fagocytose3. Desuden er Brink Mann et al. 4 beskrev neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) som en ny mekanisme, hvormed neutrofiler fælde og eliminere invaderende patogener. Siden deres opdagelse lidt over et årti siden4, har NETs været impliceret i en bred vifte af infektiøse5,6 og ikke-infektiøse7 morbiditeter. NETTO dannelse er en aktiv proces og resulterer i ekstrudering af kromatin DNA belagt med granulerede antimikrobielle proteiner8. Nogle af de vigtigste ændringer i cellulære og nukleare morfologi forbundet med netto dannelse omfatter tab af nuklear morfologi, kromatin dekoncentration, mobilisering af granulat proteiner fra cytoplasmaet til kernen og en stigning i den nukleare og cellulære diameter8,9.
De web-lignende net, som kan fremstå som diffuse strukturer lidt større end cellen eller som strukturer flere gange større end en enkelt neutrofile betragtes som indikatorer for netosis5,10. Ved hjælp af Fluorescens mikroskopi kan NETs påvises ved sondering af DNA med en fluorescerende sonde såsom 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og ved immunofluorescens farvning mod NET-bundne proteiner såsom neutrofilelastase. Kvantificering af overlappende områder for farvning af DNA og NETBUNDNE proteiner bestemmer det samlede areal under garn i et billede11.
En række billedanalyse muligheder er tilgængelige til at udføre fluorescens billedbaserede kvantificering af NETs11,12. Men disse software muligheder nuværende begrænsninger i ikke at være brugervenlig og/eller fuldt automatiseret. I denne artikel demonstrerer vi driften af NETQUANT13, en frit tilgængelig app, der kan udføre upartisk fuldt automatiseret immunofluorescens mikroskopi billedbaseret netto kvantificering. Den app har en brugervenlig grafisk grænseflade (GUI) og kan udføre en enkelt celle analyse. Softwaren kvantificerer Netose i et billede ved at detektere de morfologiske ændringer i området af DNA-NET-bundet markør, kromatin dekompensation forbundet deformation af kernen og stigning i DNA: netto-bundet protein ratio. Tilsammen giver de flere netto definitionskriterier mulighed for en stringent netto kvantificering på tværs af flere datasæt på en upartisk måde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Netto dannelsen er en relativt nylig tilføjelse til det mangfoldige neutrofiltal,4 og der har været en mærkbar bølge af interesse for at studere virkningen af NETs i en bred vifte af forskningsområder5,7,14,15. Erhvervelse af billeder ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi og efterfølgende billedbaserede kvantificering er en meget anvendt metode til kvantificer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev finansieret af Crafoord Foundation (TM og PN), den svenske regerings forskningsbevilling (PN, TM), det svenske Forskningsråd (PN) og Groschinsky Foundation (TM, PN).
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
Riferimenti
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it?. Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray – NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
