Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour générer des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et l’exploitation de NETQUANT, une option logicielle entièrement automatique pour la quantification des NET dans les images d’immunofluorescence.
Abstract
Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) sont des structures antimicrobiennes web-like se composant de l’ADN et des protéines antimicrobiennes dérivées de granule. La microscopie d’immunofluorescence et les méthodes de quantification basées sur l’image demeurent des outils importants pour quantifier la formation de pièges extracellulaires neutrophiles. Cependant, il y a des limites clés aux méthodes basées sur l’immunofluorescence qui sont actuellement disponibles pour quantifier les ENI. Les méthodes manuelles de quantification NET basée sur l’image sont souvent subjectives, sujettes à l’erreur et fastidieuses pour les utilisateurs, en particulier les utilisateurs non expérimentés. En outre, les options logicielles actuellement disponibles pour la quantification sont soit semi-automatiques ou nécessitent une formation avant l’opération. Ici, nous démontrons la mise en œuvre d’une méthode automatisée de quantification d’image basée sur l’immunofluorescence pour évaluer la formation net appelée NETQUANT. Le logiciel est facile à utiliser et dispose d’une interface utilisateur graphique conviviale (GUI). Il tient compte de paramètres biologiquement pertinents tels qu’une augmentation de la surface et du rapport protéine marqueur DNA:NET, et la déformation nucléaire pour définir la formation de l’EI. En outre, cet outil est conçu comme une application librement disponible, et permet de quantifier et d’analyser la résolution d’une seule cellule.
Introduction
Les neutrophiles sont des médiateurs cruciaux des réponses innées de défense d’hôte contre une grande variété d’agents pathogènes microbiens1. Ils exécutent leurs fonctions antimicrobiennes en libérant leurs granules contenant un large éventail de protéines antimicrobiennes2, produisant des espèces réactives d’oxygène (ROS) et de l’hypochlorite1, et par phagocytose3. En outre, Brinkmann et coll. 4 ont décrit les pièges extracellulaires de neutrophile (NETs) comme mécanisme nouveau par lequel les neutrophiles piègent et éliminent les pathogènes envahissants. Depuis leur découverte il y a un peu plus d’une décennie4, les TN ont été impliqués dans une grande variété de morbidités infectieusesde 5,6 et non infectieuses7. La formation de NET est un processus actif et entraîne l’extrusion de l’ADN de chromatine enduit de protéines antimicrobiennes dérivées du granule8. Certains des changements clés dans la morphologie cellulaire et nucléaire associée à la formation net comprennent la perte de morphologie nucléaire, la décondensation de chromatine, la mobilisation des protéines granules du cytoplasme au noyau et une augmentation du diamètre nucléaire et cellulaire8,9.
Les NET sain, qui peuvent apparaître comme des structures diffuses légèrement plus grandes que la cellule ou comme des structures plusieurs fois plus grandes qu’un seul neutrophile sont considérées comme des indicateurs de NETosis5,10. À l’aide de la microscopie à fluorescence, les TNE peuvent être détectés en sondant l’ADN à l’aide d’une sonde fluorescente comme l’élastase de 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) et par la coloration immunofluorescence contre les protéines liées au NET comme l’élastase de neutrophile. La quantification des zones de coloration qui se chevauchent pour l’ADN et les protéines liées à l’EI détermine la superficie totale sous les EE dans une image11.
Un certain nombre d’options d’analyse d’image sont disponibles pour effectuer la quantification basée sur l’image de fluorescence des NETs11,12. Mais ces options logicielles présentent des limites en n’étant pas convivialet et/ou entièrement automatisé. Dans cet article, nous démontrons le fonctionnement de NETQUANT13, une application librement disponible qui peut effectuer une microscopie immunofluorescence entièrement automatisée impartiale sur l’image de la quantification NET. L’application dispose d’une interface graphique conviviale (GUI) et peut effectuer une analyse monocellulaire. Le logiciel quantifie neTosis dans une image en détectant les changements morphologiques dans le domaine du marqueur lié à l’ADN-NET, la décondensation de chromatine a associé la déformation du noyau et l’augmentation du rapport protéine LIÉ à l’ADN: NET. Pris ensemble, les multiples critères de définition NET permettent une quantification NET rigoureuse sur plusieurs ensembles de données de manière impartiale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La formation de NET est un ajout relativement récent à l’armamentarium neutrophile diversifié4 et il y a eu un regain d’intérêt notable pour étudier l’implication des NET dans un large éventail de domaines de recherche5,7,14,15. L’acquisition d’images à l’aide de la microscopie immunofluorescence et de la quantification à base d’images subséquente est une méth…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été financés par la Fondation Crafoord (TM et PN), la subvention du gouvernement suédois pour la recherche (PN, TM), le Conseil suédois de la recherche (PN) et la Fondation Groschinsky (TM, PN).
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
Riferimenti
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