הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת נויטרופילים מלכודות (רשתות) ו-NETQUANT הפעלה, תוכנה אוטומטית לחלוטין לכמת של רשתות בתמונות immunofluorescence.
Abstract
מלכודות נויטרופילים מסחטות (רשתות) הם מבנים מיקרוביאלית כמו האינטרנט המורכב של DNA ו גרגר עושה נגזר חלבונים מיקרוביאלית. מיקרוסקופ immunofluorescence ומבוססי תמונה שיטות הקוונפיקציה להישאר כלים חשובים כדי ככמת היווצרות נויטרופילים המלכודת המבנה. עם זאת, קיימות מגבלות מפתח לשיטות המבוססות על מודלואונציה הזמינות כעת לכימות רשתות. שיטות ידניות של התמונה מבוסס הקוונפיקציה נטו הם לעתים קרובות סובייקטיבי, נוטה שגיאה מייגע עבור משתמשים, במיוחד שאינם מנוסים משתמשים. כמו כן, כיום אפשרויות תוכנה זמינות עבור כימות הן למחצה או אוטומטי או דורשים הכשרה לפני המבצע. כאן, אנו מדגימים את היישום של שיטת כימות החיסונית אוטומטית המבוססת על הטיפול כדי להעריך את היווצרות נטו בשם NETQUANT. התוכנה קלה לשימוש ויש לה ממשק משתמש גרפי ידידותי למשתמש (GUI). הוא מחשיב פרמטרים רלוונטיים ביולוגית כגון גידול בשטח פני השטח DNA: היחס החלבון סמן נטו, ואת דפורמציה גרעינית כדי להגדיר היווצרות נטו. יתר על כן, כלי זה בנוי כיישום זמין באופן חופשי, ומאפשר לכמת זיהוי תא בודד וניתוח.
Introduction
נויטרופילים הם מתווכים חיוניים של תגובות ההגנה המולדת מארח נגד מגוון רחב של פתוגנים מיקרוביאלית1. הם מבצע פונקציות מיקרוביאלית שלהם על ידי שחרור גרגירים שלהם המכיל מגוון רחב של חלבונים מיקרוביאלית2, לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS) ו רדמה1, ודרך phagocyציטוזה3. בנוסף, בריקמן ואח ‘. 4 תיאור נויטרופילים מסחטות מלכודות (רשתות) כמו מנגנון הרומן שבו המלכודת נויטרופילים לחסל פתוגנים הפולשים. מאז התגלית שלהם לפני קצת יותר מעשור, הרשתותהיו מעורבים במגוון רחב של זיהומיות5,6 ולא זיהומיות7 morbidities. היווצרות נטו הוא תהליך פעיל ותוצאות שחול של דנ א כרומטין מצופה עם granule-נגזר מיקרוביאלית חלבונים8. חלק מהשינויים המרכזיים במבנה הסלולר והגרעין הקשורים למערך הרשת כוללים את אובדן המבנה הגרעיני, הגיוס של חלבונים מציטופלסמה לגרעין וגידול בקוטר הגרעיני והסלולר8,9.
רשתות כמו האינטרנט, אשר עשויים להופיע כמבנים לפזר מעט יותר גדול מתא או כמו מבנים מספר פעמים גדול יותר מאשר נויטרופילים בודד נחשבים אינדיקטורים שלnetosis 5,10. באמצעות מיקרוסקופ ניאון, רשתות ניתן לזהות על ידי בודק דנ א עם בדיקה פלורסנט כגון 4 ‘, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) ועל ידי immunofluorescence כתמים נגד חלבונים נטו מאוגד כגון נויטרופילים elastase. הכמת של אזורים חופפים של כתמים עבור החלבונים ו-DNA נטו מאוגד קובע את השטח הכולל תחת רשתות בתמונה11.
מספר אפשרויות ניתוח תמונה זמינות כדי לבצע כימות קרינה פלואורסצנטית המבוססת על רשתות11,12. אך אפשרויות תוכנה אלה מציגות מגבלות שאינן ידידותיות למשתמש ו/או אוטומטיות לחלוטין. במאמר זה, אנו מדגימים את הפעולה של NETQUANT13, יישום זמין באופן חופשי שיכול לבצע משוחדת לחלוטין אוטומטית immunofluorescence מיקרוסקופ תמונה מבוססת נטו המבוסס. האפליקציה יש ממשק גרפי ידידותי למשתמש (GUI) והוא יכול לבצע ניתוח תא בודד. התוכנה לכמת את NETosis בתמונה על ידי זיהוי שינויים מורפולוגיים באזור של DNA-NET-מאוגד סמן, כרומטין הקשורות דפורמציה של הגרעין ולהגדיל את ה-DNA: היחס הנקי חלבון. ביחד, הקריטריונים של NET definition מרובים מאפשרים לכמת את הנטו המחמירים על פני מספר ערכות נתונים בצורה לא משוחדת.
Protocol
Representative Results
Discussion
היווצרות נטו הוא התוספת העדכנית יחסית של נויטרופילים מגוונת הארמנטריום4 והיה גל מורגש של עניין ללמוד את המשמעות של רשתות במגוון רחב של תחומי מחקר5,7,14,15. הקניית תמונות בעזרת מיקרוסקופ Immunofluorescence והשימוש העו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה ממומנת על ידי קרן Crafoord (TM ו-PN), מענק שוודי מחקר המענק (PN, TM), המועצה למחקר שוודי (PN) ו Groschinsky קרן (TM, PN).
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
Riferimenti
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it?. Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray – NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
