नेटक्वांट का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप का स्वचालित छवि-आधारित क्वांटिफिकेशन
Summary
यहां, हम न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटीएस) और ऑपरेटिंग नेटक्वांट पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों में एनईटीएस के परिमाणीकरण के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित सॉफ्टवेयर विकल्प है।
Abstract
न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटीएस) वेब जैसी एंटीमाइक्रोबियल संरचनाएं हैं जिनमें डीएनए और दाने दार ी से प्राप्त रोगाणुरोधी प्रोटीन शामिल हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और छवि आधारित क्वांटिफिकेशन विधियां न्यूट्रोफिल बाह्य जाल गठन को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण बनी हुई हैं। हालांकि, इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित तरीकों की प्रमुख सीमाएं हैं जो वर्तमान में एनईटीएस की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपलब्ध हैं। छवि आधारित नेट क्वांटिफिकेशन के मैनुअल तरीके अक्सर व्यक्तिपरक होते हैं, उपयोगकर्ताओं, विशेष रूप से गैर-अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए त्रुटि और थकाऊ होने की संभावना होती है। इसके अलावा, वर्तमान में क्वांटिफिकेशन के लिए उपलब्ध सॉफ्टवेयर विकल्प या तो अर्ध-स्वचालित हैं या ऑपरेशन से पहले प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। यहां, हम नेटक्वांट नामक नेट गठन का मूल्यांकन करने के लिए एक स्वचालित प्रतिकार आधारित छवि क्वांटिफिकेशन विधि के कार्यान्वयन को प्रदर्शित करते हैं। सॉफ्टवेयर का उपयोग करना आसान है और इसमें उपयोगकर्ता के अनुकूल ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) है। यह जैविक रूप से प्रासंगिक मापदंडों जैसे सतह क्षेत्र में वृद्धि और डीएनए: नेट मार्कर प्रोटीन अनुपात, और नेट गठन को परिभाषित करने के लिए परमाणु विरूपण पर विचार करता है । इसके अलावा, यह उपकरण एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऐप के रूप में बनाया गया है, और एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन क्वांटिफिकेशन और विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।
Introduction
न्यूट्रोफिल विभिन्न प्रकार के माइक्रोबियल रोगजनकों1के खिलाफ सहज मेजबान रक्षा प्रतिक्रियाओं के महत्वपूर्ण मध्यस्थ हैं। वे अपने कणिकाओं को रिहा करके अपने रोगाणुरोधी कार्यों को निष्पादित करते हैं जिनमें रोगाणुरोधी प्रोटीन2की एक विस्तृत श्रृंखला होती है, जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और हाइपोक्लोराइट1का उत्पादन करती है, और फागोसाइटोसिस3के माध्यम से। इसके अलावा ब्रिंकमैन एट अल । 4 ने न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (NETs) को एक उपन्यास तंत्र बताया जिसके द्वारा न्यूट्रोफिल जाल और हमलावर रोगजनकों को खत्म करते हैं। उनकी खोज के बाद से एक दशक पहले4से थोड़ा अधिक, NETs संक्रामक5,6 और गैर संक्रामक7 रुग्णियों की एक विस्तृत विविधता में फंसाया गया है । नेट गठन एक सक्रिय प्रक्रिया है और इसके परिणामस्वरूप क्रोनिलिन डीएनए का निष्कासन कण-व्युत्पन्न रोगाणुरोधी प्रोटीन8से लेपित होता है । नेट गठन से जुड़े सेलुलर और परमाणु आकृति विज्ञान में कुछ महत्वपूर्ण परिवर्तनों में परमाणु आकृति विज्ञान का नुकसान, क्रोमेटिन डिकंजेशन, साइटोप्लाज्म से नाभिक तक कणिका प्रोटीन जुटाना और परमाणु और सेलुलर व्यास8,9में वृद्धि शामिल है ।
वेब की तरह NETs, जो कोशिका से थोड़ा बड़ा संरचनाओं के रूप में प्रकट हो सकता है या संरचनाओं के रूप में कई बार एक ही न्यूट्रोफिल से बड़ा NETosis5,10के संकेतक के रूप में माना जाता है । फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, 4′, 6-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) जैसे फ्लोरोसेंट जांच के साथ डीएनए की जांच करके और न्यूट्रोफिल इलास्टेज़ जैसे नेट-बाउंड प्रोटीन के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करके एनटीका का पता लगाया जा सकता है। डीएनए और नेट-बाउंड प्रोटीन के लिए धुंधला करने वाले क्षेत्रों का परिमाणीकरण एक छवि11में NETs के तहत कुल क्षेत्र निर्धारित करता है ।
एनईटीएस11,12के फ्लोरेसेंस इमेज बेस्ड क्वांटिफिकेशन करने के लिए इमेज एनालिसिस के कई विकल्प उपलब्ध हैं । लेकिन इन सॉफ्टवेयर विकल्प उपयोगकर्ता के अनुकूल नहीं किया जा रहा है और/या पूरी तरह से स्वचालित में सीमाएं मौजूद हैं । इस लेख में, हम NETQUANT13के संचालन को प्रदर्शित करते हैं, जो एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऐप है जो निष्पक्ष पूरी तरह से स्वचालित प्रतिकार माइक्रोस्कोपी छवि आधारित नेट क्वांटिफिकेशन कर सकता है। ऐप में यूजर फ्रेंडली ग्राफिकल इंटरफेस (जीयूआई) है और यह सिंगल-सेल एनालिसिस कर सकता है । सॉफ्टवेयर डीएनए-नेट-बाउंड मार्कर के क्षेत्र में रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगाकर एक छवि में नेटोसिस की मात्रा निर्धारित करता है, न्यूक्लियस के क्रोमेटिन विवर्तन से जुड़ा हुआ है और डीएनए: नेट-बाउंड प्रोटीन अनुपात में वृद्धि होती है । एक साथ लिया, कई नेट परिभाषा मापदंड एक निष्पक्ष फैशन में कई डेटा सेट भर में कड़े नेट मात्रा करण के लिए अनुमति देता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
नेट गठन विविध न्यूट्रोफिल आयुध4 के लिए अपेक्षाकृत हाल ही में जोड़ दिया गया है और अनुसंधान क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला में NETs के निहितार्थ का अध्ययन करने के लिए ब्याज की एक उल्लेखनीय वृद्ध…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को क्रैफोर्ड फाउंडेशन (टीएम और पीएन), स्वीडिश गवर्नमेंट रिसर्च ग्रांट (पीएन, टीएम), स्वीडिश रिसर्च काउंसिल (पीएन) और ग्रोश्िंस्की फाउंडेशन (टीएम, पीएन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
Riferimenti
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