Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di trappole extracellulari neutrode (NETT) e il funzionamento di NETQUANT, un’opzione software completamente automatica per la quantificazione dei NET nelle immagini di immunofluorescenza.
Abstract
Le trappole extracellulari Neutrophil (NET) sono strutture antimicrobiche simili a reti formiche di proteine antimicrobiche derivate dal DNA e dal granulo. La microscopia dell’immunofluorescenza e i metodi di quantificazione basati sull’immagine rimangono strumenti importanti per quantificare la formazione di trape extracellulari di neutrofili. Tuttavia, esistono limitazioni chiave ai metodi basati sull’immunofluorescenza che sono attualmente disponibili per quantificare i NET. I metodi manuali di quantificazione NET basata su immagini sono spesso soggettivi, soggetti a errori e noiosi per gli utenti, in particolare gli utenti non esperti. Inoltre, le opzioni software attualmente disponibili per la quantificazione sono semi-automatiche o richiedono una formazione prima del funzionamento. Qui, dimostriamo l’implementazione di un metodo automatizzato di quantificazione delle immagini basato sull’immunofluorescenza per valutare la formazione della rete chiamata NETQUANT. Il software è facile da usare e ha un’interfaccia utente grafica (GUI) intuitiva. Considera parametri biologicamente rilevanti come un aumento della superficie e il rapporto di proteina del marcatore DNA:NET e la deformazione nucleare per definire la formazione della rete. Inoltre, questo strumento è costruito come un’applicazione liberamente disponibile, e consente la quantificazione e l’analisi di risoluzione singola.
Introduction
Neutrophils sono mediatori cruciali delle risposte innate alla difesa dell’ospite contro un’ampia varietà di patogeni microbici1. Essi eseguono le loro funzioni antimicrobiche rilasciando i loro granuli contenenti una vasta gamma di proteine antimicrobiche2, producendo specie reattive dell’ossigeno (ROS) e ipocloriterite1, e attraverso la fagocitosi3. Inoltre, Brinkmann et al. 4 ha descritto le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) come un nuovo meccanismo con il quale i neutrofili intrappolano ed eliminano gli agenti patogeni invasori. Dalla loro scoperta poco più di un decennio fa4, NETs sono stati implicati in una vasta gamma di infettive5,6 e non-infettivo7 morbilità. La formazione della rete è un processo attivo e si traduce nell’estrusione del DNA della cromatina rivestito con proteine antimicrobiche derivate dai granuli8. Alcuni dei cambiamenti chiave nella morfologia cellulare e nucleare associata alla formazione di NET includono la perdita di morfologia nucleare, decondensazione della cromatina, mobilitazione delle proteine granule dal citoplasma al nucleo e un aumento del diametro nucleare e cellulare8,9.
I NET simili al web, che possono apparire come strutture diffuse leggermente più grandi della cellula o come strutture diverse volte più grandi di un singolo neutrofilo sono considerati indicatori di NETosis5,10. Utilizzando la microscopia a fluorescenza, i NET possono essere rilevati sondando il DNA con una sonda fluorescente come la fenomenazione 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e la colorazione dell’immunofluorescenza contro le proteine del limite di rete come l’elastasi neutrofila. La quantificazione delle aree sovrapposte di colorazione per il DNA e le proteine del NET determina l’area totale sotto i NET nell’immagine11.
Sono disponibili diverse opzioni di analisi delle immagini per eseguire la quantificazione basata sull’immagine a fluorescenza dei NET11,12. Ma queste opzioni software presentano limitazioni nel non essere user-friendly e/ o completamente automatizzato. In questo articolo viene illustrato il funzionamento di NETQUANT13, un’app liberamente disponibile in grado di eseguire una microscopia a microscopia completamente automatizzata non imparziale. L’applicazione ha un’interfaccia grafica intuitiva (GUI) e può eseguire l’analisi a cella singola. Il software quantifica NETosis in un’immagine rilevando i cambiamenti morfologici nell’area del marcatore legato al DNA-NET, la decondensazione della cromatina associata alla deformazione del nucleo e l’aumento del rapporto proteico DNA:NET. Nel loro insieme, i criteri di definizione NET multipli consentono una rigorosa quantificazione NET in diversi set di dati in modo imparziale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La formazione della rete è un’aggiunta relativamente recente all’armamentario neutrofilo variegato4 e c’è stato un notevole aumento di interesse per studiare l’implicazione di NET in una vasta gamma di aree di ricerca5,7,14,15. L’acquisizione di immagini mediante la microscopia immunofluorescenza e la successiva quantificazione basata sulle immagini è un metodo ampiam…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato finanziato dalla Crafoord Foundation (TM e PN), dalla borsa svedese per la ricerca del governo (PN, TM), dal consiglio svedese per la ricerca (PN) e dalla Fondazione Groschinsky (TM, PN).
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
Riferimenti
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