Her præsenterer vi en gennemprøvet og testet protokol til rensning af grønkorn protein import komplekser (TOC-TIC kompleks) ved hjælp af tryk-tag. Et-trins affinitet-isolation protokollen kan potentielt anvendes til enhver protein og bruges til at identificere nye interaktion partnere ved massespektrometri.
Grønkorn Biogenese kræver import af tusindvis af kerne-kodet proteiner i plastid. Import af disse proteiner, afhænger af translocon på den ydre (TOC) og indre (TIC) grønkorn membraner. Indholdsfortegnelsen og TIC komplekser er multimeriske og indeholder sandsynligvis endnu ukendt komponenter. En af de vigtigste mål i feltet er den komplette fortegnelse over indholdsfortegnelsen og TIC komponenter. Til isolering af TOC-TIC komplekser og identifikation af nye komponenter ændret den preprotein receptor TOC159 har været N-terminalt ved tilsætning af tandem affinitet rensning (TAP) tag resulterer i TAP-TOC159. TAP-tag er designet til to sekventielle affinitet rensning trin (dermed “tandem affinitet”). TAP-tag bruges i disse undersøgelser består af en N-terminale IgG-bindende domæne afledt af Staphylococcus aureus Protein en (ProtA) efterfulgt af en calmodulin-bindende peptid (CBP). Mellem disse to affinitet tags, en tobak etch virus (TEV) protease kavalergang websted er medtaget. Derfor, TEV protease kan bruges til blid eluering af TOC159-holdige komplekser efter binding til IgG perler. I protokollen præsenteres her, var det andet Calmodulin-affinity rensning skridt udeladt. Rensning-protokollen starter med forberedelse og oploesning af samlede cellemembraner. Efter vaskemiddel-behandling inkuberes solubilized Membranproteiner med IgG perler for immunoisolation af TAP-TOC159-holdige komplekser. Bindende og omfattende vask, er TAP-TOC159 indeholdende komplekser kløvet og frigivet fra IgG perlerne ved hjælp af TEV protease hvorved S. aureus IgG-bindende domæne er fjernet. Western blotting af den isolerede TOC159-holdige komplekser kan bruges til at bekræfte tilstedeværelsen af kendt eller formodet TOC og TIC proteiner. Endnu vigtigere, har de TOC159-holdige komplekser været anvendt med succes til at identificere nye komponenter til indholdsfortegnelsen og TIC komplekser af massespektrometri. Den protokol, som vi præsenterer potentielt giver effektiv isolering af enhver membran-bundet protein kompleks skal bruges til identifikation af endnu ukendte komponenter af massespektrometri.
Planter afhænger grønkorn for fotosyntese og photoautotrophic vækst1. Langt størstedelen af grønkorn proteiner er kodet i kernen, syntetiseret i cytosol og importeres til chlorplasttransitpeptidsekvensen via TIC og TOC komplekser i kuvert membraner2. Kernen i indholdsfortegnelsen kompleks består af Toc75 protein-ledende kanal og to receptor GTPases Toc33 og Toc1593,4,5. TOC159 er afgørende for Biogenese af grønkorn og formidler en massiv ophobning af fotosyntese-associerede proteiner6. TIC-komplekset består af det TIC20 protein-ledende kanal samt TIC110 og TIC407,8. For nylig en 1MD protein translokation kompleks på den inderste kuvert membran blev isoleret og indeholdt tidligere uidentificerede komponenter9, hvoraf den ene var TIC56. Vi isoleret for nylig Co TIC56 af de 1 MDa komplekse ved hjælp af tryk-TOC159 affinitet rensning protokollen. Dataene, der er angivet en strukturel overlapning mellem de “canonical” TOC/TIC komplekser og 1 MDa komplekse10. Tidligere blev ukendt komponenter som KOC1 også identificeret som nye interaktion partnere af de TOC og TIC komplekser ved hjælp af tryk-metoden beskrevet her10,11.
Således er TAP-tag rensning en effektiv metode til isolering af proteinkomplekser og identifikation af interagerende partnere med efterfølgende massespektrometrisk analyse12. Tryk på tag består af to IgG bindende gentager adskilt fra en calmodulin-bindende peptid (CBP) af en tobak etch virus (TEV) protease kavalergang site. Den oprindelige metode, bestående af en IgG-affinitet rensning skridt efterfulgt af TEV kavalergang og efterfølgende calmodulin-affinitet kromatografi tilladt indfødte rensning af store og meget ren protein komplekser13,14 . Vi har forenklet proceduren og demonstreret proteinkomplekser TOC159-holdige også renset, effektivt ved hjælp af kun den IgG-affinitet rensning skridt efterfulgt af TEV-kavalergang til eluering15. Vores erfaring, udeladelsen af trinnet calmodulin-affinitet resulterede i højere udbytter og kan derfor være hensigtsmæssigt for lav overflod proteiner.
Kort sagt, vi udviklet stabile transgene A. thaliana linjer udtryk for TAP-TOC159 i ppi2 (toc159 KO mutant) baggrund og etablerede det som en pålidelig kilde til rensning af TOC-TIC komplekser. Protokol for isolation af TOC-TIC komplekse begynder med homogenisering af plantemateriale i et vaskemiddel-fri buffer. Efter centrifugering, er supernatanten kasseret. Den pellet, der indeholder den samlede membran fraktion er oploeses ved hjælp af et vaskemiddel-holdige buffer. Efter en ultra-centrifugering skridt anvendes supernatant indeholdende solubilized TOC-TIC komplekser til IgG-harpiks til affinitet rensning. Efter flere vaske trin, eluering udføres ved hjælp af en TEV protease-holdige buffer til selektivt kløver nedstrøms af IgG-bindende domæner og forsigtigt frigøre indfødte TOC159-holdige komplekser. TEV eluatet kan analyseres direkte ved Western blotting eller massespektrometri til at identificere interaktion partnere TOC15910,11,15. Metoden er også blevet brugt til at identificere posttranslationelle modifikationer af TOC15915. I fremtiden kan indfødte TOC159-holdige komplekser bruges til strukturelle undersøgelser ved hjælp af cryoelectron mikroskopi.
Vi viste, at et enkelt skridt TAP tag rensning er en særlig og effektiv metode til rensning af Arabidopsis TOC-TIC kompleks. Selvom TAP-tag tillader to successive rensning trin (IgG-efterfulgt af calmodulin affinitet rensning efter TEV protease-spaltning), mener vi, at det første affinity skridt efterfulgt af TEV protease kavalergang i mange tilfælde vil være tilstrækkeligt. Vores mål, TOC159, er lav rigelige og inddragelse af andet trin af calmodulin-affinitet overdrevent formindsket protein udbyttet, som var den vigtigste grund til at udelukke det fra vores nuværende protokol. TEV-eluering i sig selv er en meget specifikke og skånsom rensning trin, der kun vil frigive TAP-mærket målet med tilhørende interaktion partnere, mens forurener proteiner stikker ikke-specifikt til harpiks, IgG vil forblive der. Således, i kombination med trinnet IgG-affinitet, TEV eluering resulterer i en tilstrækkeligt effektiv rensning for vores og formentlig mange andre formål.
Pleje skal tages, TAP-mærket konstruktionen er fuldt funktionel in vivo. TAP-tagging kunne have potentielt skadelige virkninger på protein aktivitet, stabilitet eller lokalisering. TOC159 består af tre domæner, N-terminale sure domæne, centrale GTP-bindende domæne og C-terminale membran domæne, der forankrer TOC159 i ydre grønkorn membran2. For at undgå potentiel interferens med membran indsættelse, smeltet vi TAP-tag til N-terminus af TOC159. Fusion til N-terminus er snarere undtagelsen end reglen. Mange proteiner indeholder N-terminale målretning oplysninger og bør derfor ved markeret på C-terminus. Vi forsikrede, at TOC159 er funktionelle i vivo af komplementering af ppi2 mutant (en albino mutant mangler TOC159) med TAP-TOC159. Redning af grønne vildtype fænotype angivet, TAP-TOC159 var funktionelle15.
Rensning-protokol blev brugt til at identificere nye interaktion partnere af TOC159, der indeholdt KOC1 og TIC5610,11. I alt var ca. 30 proteiner forbundet med komplekse tyder på, at nye interaktion partnere bliver isoleret og karakteriseret i den nærmeste fremtid. Mens vi varmt anbefale TAP-tag til komplekse rensning, vil vi stadig gerne påpege, at yderligere versioner til den præsenteres her findes og kan være meget nyttigt for nogle programmer.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet var støttet af tilskud fra den schweiziske National Science Foundation (31003A_156998 og 31003A_176191) og University Neuchâtel.
NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
EDTA | Carl Roth | 8043 | |
Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
Filter paper | Whatman | 10311804 | |
Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |