Vi præsenterer her, en protokol for produktion og oprensning af proteiner, der er mærket med stabile isotoper, og efterfølgende karakterisering af protein-protein interaktioner ved hjælp af Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og individuel Thermophoresis (MST) eksperimenter.
Trådformede proteiner som vimentin give organisation inden for celler ved at give en strukturel stillads med websteder, der binder proteiner der indeholder plakin gentages. Her, er en protokol til påvisning og måling af sådanne interaktioner beskrevet ved hjælp af domænet kugleformede plakin gentagelse af envoplakin og vimentin spiralformet spolen. Dette giver et grundlag for at afgøre, om et protein binder vimentin (eller lignende trådformede proteiner) og til måling af affinitet af interaktionen. Den kugleformede protein af interesse er mærket med 15N og titreres med vimentin protein i løsning. En to-dimensionel NMR-spektrum er erhvervet til at registrere interaktioner ved at observere ændringer i peak form eller kemiske Skift og belyse virkningerne af løsning betingelser herunder salt niveauer, som påvirker vimentin kvaternære struktur. Hvis interesse protein binder de trådformede ligand, er bindende interaktion kvantificeret af MST ved hjælp af de rensede proteiner. Tilgangen er en enkel måde til at bestemme, om et protein af interesse binder en glødetråd, og for at vurdere, hvordan forandringer, såsom mutationer eller løsning betingelser, påvirker samspillet.
Interaktioner mellem proteiner tillader dannelsen af molekylære maskiner, der skaber orden i celler. De enkelte interaktioner er ofte svag men normalt bidrage til multivalent komplekser, der kan være samarbejdsvillig og dynamisk reguleret. Følsomme assays, der giver atomic opløsning og kvantitative oplysninger om sådanne komplekse interaktioner er nødvendige for at udlede mekanismer og design indgreb såsom narkotika-lignende molekyler. NMR spektroskopi er en effektiv metode til at opnå sådanne oplysninger om protein interaktioner, og også bruges til hurtig screening for ligander, herunder dem, der binder svagt1. NMR metoderne kan inddeles i dem, der er protein observere eller ligand observere. Dette manuskript bruger den tidligere tilgang, hvor et spektrum af en stabil-isotop mærket protein, der er forholdsvis små (normalt under 20 kDa) er erhvervet og de umærkede ligand titreres. Dette tillader mærket rester involveret i samspil kan kortlægges i gunstige tilfælde. En gang de komplekse former, der er ændringer i de kemiske miljøer af interagerende rester, der manifesterer sig som ændringer i det kemiske Skift og form af deres NMR-signaler. Omfanget af sådanne forandringer korrelerer med graden af involvering af disse grupper i interaktionen. Kemiske Skift perturbationer (CSP) kan måles ved at sammenligne en serie af NMR-spektre af protein indsamlet i fravær og tilstedeværelsen af forskellige mængder af en ligand. For større ligander eller komplekse samspil, kan ændringen i peak formen eller intensitet måles for at udlede interaktioner.
Den mest almindelige 2D eksperiment anvendes til at påvise ligand interaktioner er 15N-heteronuclear enkelt quantum korrelation (HSQC) eksperiment2. Dette kræver, at et protein mærkes ensartet med 15N, som opnås typisk ved at udtrykke dem som affinitet-tagged versioner i E. coli bakterie kulturer vokset i 15N-beriget medier. Bindende er tilsyneladende, når HSQC spektrene indsamlet under titreringen er overlejret, afslørende peak ændringer for en delmængde af restkoncentrationer involveret i komplekse dannelsen. Samspillet kan forekomme i hurtig udveksling regimet hvor fri og ligand-mættet stat signaler kollaps i en befolkning i gennemsnit peak. Alternativt, for langsomme udvekslingen mellem staterne, begge signaler er observeret med integraler, der repræsenterer deres relative mængder. Mens NMR lineshape analyse kan anvendes til at anslå de bindende tilhørsforhold i nogle tilfælde, metoder som MST har også vist sig praktisk og give cross-valideringen af ægte interaktioner.
Det viste eksempel er af to proteiner, der findes inden for desmosomes. De mægle kryds mellem celle overflader og cytoskelettet og mægle multivalent interaktioner mellem celle vedhæftning maskiner og mellemliggende filamenter at opretholde integriteten af huden og hjertet væv og modstå af shear styrker. Sygdomme kan medføre når desmosomal proteiner som desmoplakin eller vimentin er kompromitteret af mutationer eller autoantistoffer, fører til destabilisering af celle-celle vejkryds, og dermed deres interaktioner er af kritisk betydning3. Det strukturelle grundlag for ligand binding af desmosomal proteiner kan være kendetegnet ved NMR spektroskopi, mens interaktionerne kan kvantificeres af MST. Metoderne heri blev brugt til at karakterisere interaktioner mellem plakin gentage domæner (fattigdomsbetingede sygdomme), der ofte er til stede som tandem sæt, der tilbyder grundlæggende riller og vimentin, en mellemliggende glødetråd, der interagerer gennem en sure overflade tilbød af dens spiralformet bundt4. Disse komplekser er dannet på cellemembranen hvor de anker for mellemliggende filamenter af celle cytoskelettet til desmosomes, der opretter forbindelse til tilstødende celler, som danner et netværk af selvklæbende obligationer, der udstråler i hele en væv.
Den 2D 15N-løst NMR eksperiment er en af de mest udbredte metoder til at vise hvor to molekyler interagere. Det er den mest informationsrige metode, der giver mulighed for begge parter signaler overvåges løbende i hele en titrering eksperiment i løsning tilstand. Selvom typisk kvalitative for store komplekser, kan metoden også bruges i gunstige tilfælde måle bindende tilhørsforhold hvor NMR-signaler kan spores i høj opløsning spektre. Hvis tildelinger kan foretages bekvemt, kan som for mange proteiner under 20 kDa i størrelse, bindingsstederne også tilknyttes. Supplerende assays som MST kvantitative oplysninger om interaktioner i løsning og kræver mindre protein i umærkede stater. Sammenligning af mutant bindende oplysninger er nyttige for den kontrol for at sikre, at interaktioner dokumenteres NMR linje udvidelse er ægte og ikke artefakter af, for eksempel, sammenlægning eller viskositet ændringer.
Protein udtryk
Strømline udtryk proces reducerer mængden af labor intensiv protein produktion. En del af denne optimeringsproces indebærer identificering af en passende stamme af E. coli i udtrykket rekombinante protein. Stamme præference afhænger elementer, herunder karakteren af vektoren i brug, og mere specifikt den ultimative stabilitet af rekombinante protein bliver udtrykt7. Risikoen for nedbrydning af heterolog protein af endogene E. coli proteaser kan reduceres ved brug af protease mangelfuld E. coli som BL21 stammen. For gener der indeholder sjældne kodon, kan en stamme som BL21-CodonPlus (DE3) RIPL være at foretrække. Denne stamme kombinerer protease mangelfuld karakter af BL21 stammen med yderligere endogene kopier af sjældne codon tRNAer for arginin, isoleucin, prolin og leucin. Alternativt, sjældne kodon, der kan kompromittere overekspression kan undgås ved at bestille en codon-optimeret konstruktion fra en kommerciel kilde. Mange stammer af E. coli er til rådighed for rekombinante genekspression, hver optimeret til omgåelse af et bestemt problem under udtryk7. I forbindelse med denne undersøgelse produceret standard protease mangelfuld stamme BL21(DE3) tilstrækkelige mængder af opløseligt protein for efterfølgende oprensning og analyse.
Protein oprensning
Rensning-protokollen for et bestemt protein er ofte unikke i den forstand, at hver protein forbliver stabil og opløselige under forskellige forhold såsom temperatur, salt koncentration eller pH. Den samlede effektivitet af rensning gennem affinitet kromatografi er også følsomme over for koncentrationen af fremstilling arter såsom imidazol på forskellige trin i rensningsprocessen. I dette arbejde var kritisk buffer betingelserne for IMAC pH for E-PRD og imidazol koncentration for VimRod. En pH-værdi på 7,5 var forpligtet til at undgå udfældning af E-PRD efter indledende eluering fra kolonnen IMAC. Til IMAC rensning af VimRod, blev øge koncentrationen af imidazol fra 30 til 50 mM i kolonne wash skridt fundet til at have en væsentlig forbedring i renheden af de endelige eluering fraktioner. For trinnet eluering blev øger koncentrationen af imidazol fra 250 til 350 mM også fundet til at forbedre udbyttet af den endelige eluering. Første forsøg på at eluere protein ved hjælp af 250 mM imidazol førte til ufuldstændige eluering af VimRod som det fremgår af en endelig 1 M imidazol strimmel af kolonnen (data ikke vist). Øger imidazol koncentrationen til 350 mM for eluering var tilstrækkeligt til at genoprette alle protein bundet til kolonnen. S kan tjene et dobbelt formål, fordi det fungerer som en polering skridt for protein oprensning mens samtidig udfører buffer exchange. Buffer exchange er et kritisk skridt for efterfølgende bindende analyse, da det fjerner imidazol bruges til elueres His6-mærkede protein. Det fungerer også som en mulighed for at ændre forhold såsom salt koncentration eller pH, hvilket kan påvirke effektiviteten af visse downstream teknikker eller assays. Protein, der termisk Skift (PTS) kan bruges til at identificere optimale buffere for downstream assays, især for dem, der kræver stabile protein for længerevarende perioder på stuetemperatur8,9.
Bindende analyse
Protein, som er frisklavet er kritisk for nøjagtig bindende assays, selvom frosne protein kan også bruges, så længe resultaterne sammenlignes. Trådformede proteiner som vimentin multimerize i en salt og pH afhængig af mode, og dermed løsningen betingelse skal optimeres og oligomere status vurderet af en metode som sek10,11, dynamiske lys spredning 12 eller analytisk ultracentrifugering13,14,15. NMR spektroskopi er velegnet til måling af ligand interaktioner af små proteiner med atomic opløsning. Men når et protein interagerer med større molekyle, langsommere tumbling ensues, og dette resulterer i tab af signaler, som kan bekræfte bindende, selvom det ikke nødvendigvis tillade kortlægning af bindende websteder, hvilket også kræver tildeling af mindst rygraden resonanser. I dette scenario tillader NMR eksperimenter ikke identifikation af webstedet interaktion. Dermed instrueret site mutagenese er anvendt til at identificere de kritiske restkoncentrationer behov for bindingen. Sådanne mutanter udviser derfor ikke tab af signal. I denne protokol, en mutant form med en substitution på position 1914 bevarer de maksimale intensiteter i tilstedeværelsen af VimRod og bekræfter derfor afbrydelse af samspillet mellem E-PRD og VimRod. Tildeling af rygraden og sidechain resonanser ville tilføje værdi til denne tilgang, især som struktur for den gratis E-PRD er blevet løst af røntgenkrystallografi4. Fremtidige anvendelser af NMR omfatter karakterisering af komplekse samspil mellem større molekyler og vil drage fordel af ultra høj felt magneter og brugen af andre observerbare grupper såsom 13C-mærket og trifluor methylgrupper som journalister.
MST har en række fordele for at studere bindende interaktioner16. De bindende partnere er gratis i løsning og ikke immobiliseret. Analyse af kvaliteten af prøverne, der er indbygget i software med kvalitetskontrol rapportering af sammenlægning, adsorption til kapillærer eller utilstrækkelig fluorescerende mærkning af target-molekylet. Små mængder af målet bruges typisk, koncentrationen af mærket målet er normalt mellem 20-50 nM i en 10-20 μL volumen/reaktion. Denne protokol bruger meget lille reaktion mængder (10 μL) at maksimere koncentrationen af ligand, der kan opnås i titreringer giver svag bindende interaktioner at karakteriseres. Dette nødvendiggør præcis pipettering og omhu til at undgå at indføre bobler samtidig stadig grundigt blanding. Passende blanding er kritisk for nøjagtige og ensartede fluorescens målinger langs sæt af serielle fortyndinger. Mængden af Tween-20 i MST eksperimenter blev reduceret fra en standard 0,05-0.015% lavere tendens til at skabe bobler og forbedre blanding.
RØD-Tris-NTA farvestof giver en hurtig, nem og bekvem måde at fluorescently mærke et protein, der har en hans tag. Mærkning er effektivt gennemført på kun 30 minutter og er meget stram, så ingen farvestof fjernelse procedure er nødvendig. Ingen ændringer er foretaget til aminosyrerester i det protein, der kan ændre ligand bindende egenskaber. En advarsel er, at kun protein til at være mærket skal have et His6 tag. Dette kræves kløvningen af tag fra ligand protein, E-PRD og fjernelse af tag og uncleaved E-PRD med en anden IMAC kolonne trin. Hvis det er muligt, ligand protein bør tilberedes uden brug af en hans tag. Alternativt, proteiner kan være kovalent mærket med en fluorophore gennem Amin kobling til lysin restkoncentrationer eller thiol kobling cystein restprodukter. Dog skal udvises forsigtighed, ved hjælp af sådanne systemer siden den kovalente tilknytning af en fluorophore kan påvirke elektrostatisk eller polar bindende interaktioner afhængige af lysin eller cystein restkoncentrationer. Kvantificering af bindende affinitet mellem VimRod og E-PRD af MST var usædvanligt følsom over for salt koncentration. Dette problem blev dæmpet af oprindeligt dialyzing både destinations- og ligand i det samme parti af analysebuffer. Mætning af MST bindende kurve kunne dog ikke blive nået, når du udfører MST assay i overværelse af 150 mM NaCl på grund af den komplekse opførsel af VimRod. Pålidelige og fuldstændige data er opnået når koncentrationen af NaCl blev sænket til 10 mM muliggør præcis beregning af KD. Dermed, omhyggelig optimering løsning betingelser og sammenligning med supplerende assays anbefales at opnå solide resultater. MST kan desuden bruges til at kvantificere den salt afhængighed for en given interaktion, kvantificere støkiometriske egenskaber af protein interaktioner, monitor proteinfoldning og sonde ind i enzym kinetik17.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt har været støttet af NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002 C) og Alberta Prion Research Institute / Alberta innoverer Bio Solutions (201600018), tildelt til M.O og genom Canada og Canada Foundation for Innovation tilskud til The Metabolomics Innovation Centre (TMIC) og NANUC.
Monolith NT.115, includes control and analysis software | NanoTemper Technologies | MO-G008 | Instrument for microscal thermophoresis |
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA | NanoTemper Technologies | MO-L008 | RED-tris-NTA dye for MST |
Standard capillaries | NanoTemper Technologies | MO-K022 | capillaries for MST |
HisTrap HP, 5 mL | GE Healthcare | 17524801 | IMAC column |
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 88222 | IMAC resin |
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | SEC column |
TEV protease | Sigma Aldrich | T4455 | cleavage of his tag from E-PRD |
BL21(DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527H | cells for protein expression |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free | Sigma Aldrich | 11873580001 | protease inhibitors for protein purification by IMAC |
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | reducing agent for protein purification |
Reagents (HEPES, NaCl, etc) | Sigma Aldrich | various | Preparation of media and buffers |
Ammonium chloride (15N, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467 | isotope labelling for NMR |
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2259 | NMR sample preparation |
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-8206 | reference for NMR |
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long | SJM/Deuterotubes | BOROECO-5-7 | NMR tubes |
NMR spectrometer (14.1 Tesla) | Bruker | acquisition of NMR data | |
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe | Bruker | acquisition of NMR data | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Bruker TopSpin 4.0.1 | Bruker | processing of NMR data | |
MO.Control | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 | |
MO.Affinity Analysis | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 |