Her presenterer vi hvor liten vinkel X-Ray spredning (SAXS) kan brukes til å få informasjon om lav oppløsning konvolutter representerer macromolecular strukturer. Når den brukes sammen med høy oppløsning strukturelle teknikker som Røntgenkrystallografi og kjernefysiske magnetisk resonans, kan SAXS gi detaljert innblikk i replikasjonen proteiner og macromolecular komplekser i-løsning.
Protein-protein interaksjoner med proteiner med flere globular domener presentere tekniske utfordringer for å bestemme hvordan slik komplekser form og hvor de er orientert/plassert. Her, er en protokoll med potensial for Klargjørende hvilke bestemte domener megle interaksjoner i multicomponent systemet gjennom ab initio modellering beskrevet. En metode for å beregne løsning strukturer av makromolekyler og samlingene er gitt som involverer integrere data fra liten vinkel X-ray spredning (SAXS) og kromatografi atomic oppløsning strukturer sammen i en hybrid tilnærming. Et konkret eksempel er komplekset av full lengde nidogen-1, som samler ekstracellulær matrix proteiner og danner en utvidet, buede nanostructure. En av sine globular domener festes til laminin γ-1, som strukturer kjelleren membranen. Dette gir et grunnlag for å fastslå nøyaktig strukturene av fleksible replikasjonen protein komplekser og aktiveres som synchrotron kilder kombinert med robotikk og størrelse utelukkelse kromatografi sikkerhetssystemer. Denne kombinasjonen muliggjør rask analyse der flere oligomeric stater skilles like før SAXS datainnsamling. Analysen gir informasjon om radius gyration, partikkel dimensjon, molecular form og interdomain sammenkobling. Protokollen for å generere 3D-modeller av komplekser omrisset høyoppløselig strukturer av komponenten proteiner er også gitt.
Celler inneholder intrikate nettverk av proteiner som molekylær maskiner å gjennomføre cellulære funksjoner som signaliserer cascades og opprettholde strukturell integritet. Som disse ulike komponenter flytte og arbeide i et tredimensjonalt rom gir opphav til bestemte funksjoner av macromolecules. Betydningen av proteinstruktur, dynamikk og interaksjoner å bestemme funksjonen har gitt behovet for kontinuerlig utvikling, komplekse teknikker å måle disse egenskapene. Av disse kjernefysiske magnetisk resonans (NRM), Røntgenkrystallografi (XRC) og mer nylig Cryo-elektron mikroskopi (CEM) gir høy oppløsning strukturinformasjon. Men XRC og CEM gi strukturer av en av mange biomolecular stater og mangler informasjon om dynamikken av protein, mens 3D proteinstrukturer av NMR er vanligvis begrenset til mindre globular proteiner. En måte å overvinne disse begrensningene er å utnytte liten vinkel X-Ray spredning (SAXS) for å generere molekylær konvolutter stor trafikk og kompleksbundet systemer, og kombinerer høy oppløsning stive macromolecular strukturer for å belyse den globale arkitektur og dynamiske funksjoner.
SAXS produserer lav konvolutter av macromolecular komplekser med en oppløsning på omtrent 10-20 Å 1, gi innsikt ikke bare i strukturen, men også dynamiske egenskapene som komplekset viser. Selv SAXS benytter røntgenbilder for å avdekke molekylære strukturen, er det i motsetning til XRC at tilfeldig isotropic retningen på partikler i løsningen ikke føre til Diffraksjon, men heller til spredning, som kan gi Atom løsning. I stedet genereres et elektron “konvolutten” av Makromolekyl som representerer et gjennomsnitt av konformasjonen som Makromolekyl viser. Denne informasjonen kan brukes i direkte montering av tidligere løst atomic oppløsning strukturer for å antyde regioner av fleksibilitet i en enkelt protein eller delenhet organisasjon eller dynamikk i et større, flere protein kompleks. SAXS data samles på synchrotrons med høy energi monokromatisk røntgenstråler eller fra interne kilder, som tilbyr en svakere røntgenstråler kilde som krever timer i stedet for sekunder av prøven eksponeringstid (figur 1). SAXS data samles ofte fra flere prøver med et enkelt eksperimentelle oppsett og buffer, krever en utvidet tid til å samle en rekke nyttige data på et system. Prøver bør derfor være stabile og ikke-samles i minst et par timer basert på verifiserbar kvalitetskontroll metoder som dynamisk lysspredning (DLS) og/eller analytisk ultracentrifuge (AUC) analyse å få høy kvalitet SAXS data2 , 3. her vi gir en praktisk beskrivelse av SAXS, prinsippene bak sin bruk, fordeler, begrensninger og eksempel forberedelse og fokusere tungt på innsamling og analyse, sammen med rørende kort på ab initio modellering bruker den ekstracellulær matrix proteiner nidogen-1 og laminin γ-1 eksperimentelle eksempel.
Prinsipper, fordeler og begrensninger av SAXS:
Den styrende principle(s) bak SAXS er relativt enkel: en løsning for den monodispersed macromolecule(s) rundt er plassert i en kapillære og er utsatt for en høy energi monokromatisk røntgenbilde stråle. Fotoner gjøre elektroner av atomic skallet begynner oscillerende, resulterer i en sfærisk bølge som slippes ut av samme energi og bølgelengde. Siden hver elektron vil svinge, en konstant bakgrunn vil oppnås, og resulterende elektron tetthet i Makromolekyl kontrasteres til bakgrunnen. Resulterende spredning intensiteten samles som en funksjon av spredning vinkelen, 2Θ (figur 1).
Mens andre teknikker som XRC, NMR og CEM gir strukturell informasjon til Atom-nivå, det er flere fordeler til SAXS som andre teknikker ikke kan gi. SAXS kan utføres i nesten alle buffer og krever ikke noen spesielle eksempel forberedelser. Dette er spesielt viktig i å studere atferd og strukturen i makromolekyler under varierende forhold, for eksempel tilstedeværelse eller fravær av mono – eller divalent kasjoner eller endringer i pH4,5. SAXS har muligheten til å gi informasjon om fleksibel områder en Makromolekyl6, noe de andre børsnoterte teknikkene kan sliter med. Derfor kan SAXS brukes som en sterk gratis teknikk med den stabile delen av en Makromolekyl blir studert med XRC, NRM eller CEM og hele Makromolekyl eller komplekse analysert i lav oppløsning med SAXS og kombinert med forskjellige analyseverktøy som slike som FoXSDock7 eller CRYSOL8. Siden SAXS er en løsning teknikk, brukes det ofte å bekrefte hvis statiske strukturer som de fra XRC er konsekvente i løsning6. SAXS har også fordelen av å være en teknikk som krever en relativt liten mengde eksempel investeringer (vanligvis 50-100 µL) og en relativt liten mengde eksperiment tid (30 min – 1 h).
Den største begrensningen av SAXS er prøven aggregering og/eller fornedrelse, som kan føre til feilaktige strukturelle spådommer. En samling, så lav som 5%, kan spre lys i svært høye mengder, fører til en overvurdering av maksimal partikkel dimensjon (DMaks) og radius av gyration (Rg). På den annen side, kan prøve fornedrelse føre til lavt molekylær egenskaper. Dette sikkerhetsproblemet oppstår fra SAXS blir en snitt teknikk, som betyr at prøven homogenitet er kritisk for å oppnå pålitelige og reproduserbar. Noen eksempler som skal analyseres av SAXS bør derfor gjennomgå flere metoder for rensing og homogenitet sjekker, som denaturing og innebygd gel geleelektroforese, størrelse utelukkelse Ture, dynamisk lys spredning, og analytisk ultracentrifugation. Ofte kjører SAXS beamlines prøver gjennom høy ytelse flytende kromatografi som en siste kvalitetssikring trinn før SAXS (S-SAXS)3,9. SAXS data skal samles i flere konsentrasjoner og de Rg hvert datasett skal sammenlignes, sikrer en nær likhet for å unngå interparticle vekselsvirkningene og aggregering, som resulterer i en overvurdering av partikkel dimensjoner, fører til unøyaktige dataanalyse og modellering. Siden spredning er avhengig av både konsentrasjon og størrelse, kan mindre makromolekyler kreve en mer spesifikk optimalisering av området konsentrasjon. Dette skyldes Gjensidighet teoremet, hvor store størrelser scatter mot små vinkler og små størrelser mot store vinkler. Dette manifesterer i datainnsamling, der IO er proporsjonal med R6, der R er radius partikkel. Et siste begrensning av SAXS er potensialet for stråling skader prøven under eksponering, som kan føre til forvrengning av dataene. Det er lurt å sammenligne prøve kvalitet før og etter SAXS eksempel eksponering å sikre dette ikke skjer.
De avgjørende skritt av SAXS dataanalyse i delen protokollen denne papir Inkluder buffer subtraksjon, Guinier analyse, Kratky analyse, sammenslåing av data og P(r) distribusjon. Ab initio perle modellering for omfattende dekkes her i detalj og derfor bare dekket kort.
Synchrotrons (f.eks DESY i Tyskland, DIAMANT i Storbritannia og ESRF i Frankrike), er det mulig å samle inn SAXS data for en svært liten brøkdel (~ noen µL) av hvert utvalg som fraksjoner er som elut fra kolonnen s dvs koblet innebygd (se figur 1 ). Elastisk spredte SAXS dataene er radiellt gjennomsnitt bruker pakkene levert av instrumentet produsenten eller synchrotron før bufferen subtraksjon kan finne sted. 1D resultatdataene representerer mengden spredte lys (i jeg(q)) på Y-aksen og spredning vinkel (q= 4πsinθ/λ, der λ er bølgelengdeområdet av hendelsen X-stråler) og er skissert i figur 1. Programmet PRIMUS/qt12 brukes direkte trekke noen bakgrunn på grunn av buffer og er beskrevet i avsnitt 1.1. Andre programmer som; ScÅtter43 (nedlasting tilgjengelig på www.bioisis.net) med en opplæring som er tilgjengelig på https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA, og bioXtas rå44 (tilgjengelig på https:// bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) kan brukes som et alternativ til ATSAS pakken.
Guinier analysen gir informasjon om eksempel aggregering og homogenitet samt gi Radius av Gyration (Rg) for Makromolekyl på rente basert på SAXS data fra den lave s regionen14. Et plott er konstruert med PRIMUS/qt for SAXS data fra hver konsentrasjon, etterfulgt av kurven som passer med maksimal rekkevidde på opptil 1,30 for q x Rg. En monodispersed utvalg forberedelse bør gi en lineær Guinier handling i denne regionen (figur 2D), mens aggregering resultater i en lineær Guinier plot15,16. Hvis Guinier analysen er lineære, kan graden av “unfoldedness” av en Makromolekyl rundt observeres med Kratky handlingen, som er nyttig når man beslutter å utføre rigid kropp modellering eller konstruere ensembler lavoppløselig modeller. En globular protein vises i en Kratky plot har en klokkeformet kurve, mens utvidet molekyler eller falset peptider vises platået eller selv øke i større q området og mangler bell-figuren (figur 2C).
Få Rg fra Guinier analyse vurderer bare datapunkter fra lav q regionen av 1 D spredningsdiagram (figur 2D), men det er mulig å bruke nesten hele datasettet for å utføre en indirekte Fourier transformasjon konvertere gjensidige-space informasjon om ln (I (q)) vs (q) til en ekte verdensrommet avstand fordeling (P(r)) som gir informasjon om DMaks og Rg (Figur 2B) Formen på P(r) handlingen representerer brutto løsning konformasjon av Makromolekyl rundt18,19. konvertering av gjensidig områdedata til real-områdedata er et kritisk punkt, men en detaljert beskrivelse er ikke innenfor dette papiret. Derfor se en artikkel av Svergun20 å forstå hver parameter.
Når bufferen trukket data personlige konsentrasjoner behandles gjennom Guinier analyse med en konsekvent verdi for Rg, etterfulgt av undersøke sine folding mønster Kratky analyse, disse dataene kan flettes. De flettede dataene presenteres for nidogen-1, laminin γ-1 og deres komplekset ble behandlet som beskrevet ovenfor, og den resulterende P(r) tomter i finne 2B. Ideelt sett bør man også beregne den par-avstand funksjonen P(r) for hver konsentrasjon å finne ut om SAXS samles for hver konsentrasjon gir lignende Rg og DMaks verdier. Hvis Rg og Dmax er like over en rekke konsentrasjoner, bør så du fortsette. Det bør bemerkes at avhengig av signalet, data kan bli avkortet før fletting av data. Dette er ofte tilfellet hvis den konsentrasjoner og/eller molekylvekt av macromolecules under etterforskning er lav.
Lav form analyse ved hjelp av DAMMIN kan utføres i ulike moduser (f.eks rask, sakte, ekspert modi, osv.). Rask modus er en ideelle første skrittet evaluere hvis P(r) handlingen gir god kvalitet modeller. Vanligvis kan minst 10 modeller skaffes for hver P(r) plott å sjekk hvis reproduserbar resultatene med lav oppløsning strukturen, er oppnådd, med en lav godhet av fit parameter som heter χ (en verdi på 0,5-1.0 regnes som god basert på vårt omfattende arbeid ), en verdi som beskriver en avtale mellom eksperimentelt samlet SAXS og modell-avledet data. For publikasjonen formål, vi vanligvis bruker langsom eller ekspert modus og Beregn minst 15 modeller. DAMMIN, en raskere versjon av det DAMMIF37, samt GASBOR38 er også alternativer. Videre for å studere protein-protein eller protein-nukleinsyre komplekser, er det mulig å bruke den MONSA programmet35, som muliggjør samtidige montering av de individuelle SAXS dataene for både makromolekyler samt deres komplekse. Mer om høyoppløselige modell beregninger samt for RNA-protein samhandling studier, se en nylig artikkel av Patel et al3.
SAXS er teoretisk enkel, men utvilsomt en svært utfyllende metode til andre strukturell biologi verktøy og resultater i lav oppløsning strukturelle data som kan brukes på egen hånd eller sammen med høy oppløsning teknikker for å belyse informasjon om macromolecular struktur og dynamikk. Så lenge en monodispersed forberedelse makromolekyler og deres komplekser kan oppnås, kan SAXS brukes til å studere i-løsning struktur og interaksjoner type biologiske Makromolekyl. Ved komplekset diskutert her, er det bemerkelsesverdig at mindre enn 10% av total tilgjengelig arealet av nitrogen-1 og laminin γ-1 er gravlagt i dette komplekset, mens resten av domener av begge proteiner er fritt tilgjengelig til å samhandle med andre proteiner på ekstracellulær matrix å opprettholde sin strukturell stabilitet (Figur 3). Innhenting av slik informasjon for et kompleks med ~ 240kDa ville være svært utfordrende bruker andre strukturell biologi teknikker som Røntgenkrystallografi, NMR og Cryo-EM mikroskopi.
Avdekke proteinstruktur via Røntgenkrystallografi eller NMR er en iboende tidkrevende prosess. Denne flaskehals i proteinstrukturer er et område hvor SAXS viser sin styrke som en strukturell teknikk; datainnsamling for ett enkelt SAXS eksperiment kan ta mindre enn en time, og med hjelp av strømlinjeformet analyseprogramvare, analyse kan gjøres raskt og effektivt. SAXS har potensial til å øke gjennomstrømming strukturelle studier som en frittstående teknikk fordi det tilbyr en lav oppløsning modell av macromolecular før høyoppløselig data er tilgjengelige. En barriere til andre strukturelle teknikker er behovet for en svært ren, konsentrert utvalg for datainnsamling, som nødvendiggjør høy protein uttrykk og stabilitet over lang tid. Mens SAXS prøver også måtte være ren og konsentrert, prøve volumene er omtrent 100 µL gjør SAXS en relativt rimelig metode for analyse sammenlignet med andre strukturelle teknikker. Videre er SAXS kombinert med størrelse utelukkelse kromatografi stadig mer vanlig som gir et ekstra kvalitetskontroll skritt. Nylig har det vært sterke fremskritt i kombinasjonen av NMR og SAXS data ved hjelp av Ensemble optimalisering metoden (EOM)45,46 for å belyse fleksibel systemer. I en nyere artikkel av Mertens og Svergun47beskriver forfatterne flere nyere eksempler på EOM SAXS i kombinasjon med NMR, sammen med mange andre eksempler på SAXS data brukes i forbindelse med NMR. Fremskritt blir stadig blir gjort innen SAXS, og nye teknikker blir utviklet for SAXS som skal brukes sammen med, ikke bare gratis til andre strukturelle teknikker. Vi tror derfor at etterspørselen etter SAXS bare vil øke over tid, spesielt i forbindelse med NMR å karakterisere dynamiske systemer der funksjoner er definert av fleksibilitet.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet har blitt støttet av NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta innovasjon Program (RCP-12-002 C) og Alberta Prion Research Institute / Alberta fornyer Bio løsninger (201600018) tilskudd tildeles M.O. TRP er en Canada forskning stol i RNA & Protein biofysikk (201704) og erkjenner NSERC Discovery grant (RGPIN-2017-04003). TM er finansiert av NSERC funnet stipendet til TRP.
HEK 293 EBNA Cell Line | In-Lab availability | – | Cell line used to overexpress protein(s) |
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin | GE Healthcare | 17524801 | Affinity protein purification resin |
Superdex 200 Increase 10/300 | GE Healthcare | 28990944 | SEC Column |
ÄKTA Pure FPLC | GE Healthcare | – | FPLC System |
Nanodrop | Nanodrop | – | Spectrophotometer |
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.) | |||
S-MAX3000 | Rigaku | – | SAXS Pinhole Camera System |
Zetasizer Nano-S | Malvern Instruments Ltd | – | Dynamic Light Scattering instrument |
0.1µm Filter | Millipore | JVWP04700 | Used to Concentrate Sample Prior to DLS |
Thrombin cleavage kit | abcam | ab207000 | Thrombin cleavage to remove His tag |
Strep-Tactin Sepharose Column | IBA | 2-1201-010 | Strep-Tag Affinity Purification |
D-desthiobiotin | Sigma-Aldrich | 533-48-2 | Elution of Strep Tag Protein |
Software | |||
SAXGUI | Rigaku | – | Data Collection for SAXS and data reduction |
ATSAS Suit | Franke et al., 2017 | – | SAXS Data Analysis Software program suite |
PRIMUS | Konarev et al., 2003 | – | Buffer Subtraction |
GNOM | Svergun, 1992 | – | Rg, Dmax and p(r) Calculation |
DAMMIF | Franke and Svergun, 2009 | – | Ab initio model calculation |
DAMAVER | Volkov and Svergun, 2003 | – | Averaged Solution Conformation calculations |
MONSA | Svergun, 1999 | – | Simultaneous model fitting for the complex |
GASBOR | Svergun et al., 2001 | – | Alternative Ab initio model calculations |
DTS Software V6.20 | Malvern Instruments Ltd | – | DLS supplied instrument software |
PyMOL | Schrodinger, LLC. | – | The PyMOL Molecular Graphics System V2.0 |
The Protein Data Bank | Berman et al., 2000 | – | PDB ID: 1NPE |