Morfométricos protocolo para a avaliação objetiva do comportamento de blastocisto durante a vitrificação e aquecimento passos
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo morfométricos lapso de tempo para acompanhar a intensidade do encolhimento de blastocisto e re-expansão durante as intervenções de previtrification e recuperação pós-aquecimento. A aplicação do protocolo, é possível em vitro laboratórios fertilização equipados com microscópios de lapso de tempo e recomenda-se no desenvolvimento de um método de vitrificação de blastocistos ideal.
Abstract
Este artigo descreve o método não-invasivo de blastocisto morfometria baseada em microfotografia lapso de tempo para o controlo rigoroso do volume de um blastocisto mudando durante as fases individuais antes e após a vitrificação. O método pode ser útil na busca para o sincronismo mais ideal de exposição de blastocisto a diferentes concentrações de crioprotectores observando o encolhimento de blastocisto e re-expansão em diferentes pré- e pós-vitrificação fases. Com esta metodologia, o protocolo de vitrificação de blastocistos pode ser otimizado. Para uma melhor demonstração da utilidade deste método morfométrico, dois protocolos de preparação diferente blastocisto para vitrificação são comparados; com o uso de um blastocoel artificial em colapso e sem esta intervenção antes de vitrificação. Ambas as variações de volume dos blastocistos são seguidas por lapso de tempo microfotografia e medidas por ferramentas de software de edição de fotos. As medidas são feitas em 20 segundos em fases de previtrification e a cada 5 minutos no período pós-aquecimento. As alterações das dimensões blastocisto por unidade de tempo são apresentadas graficamente em diagramas de linha. Os resultados mostram uma fase de previtrification longo de equilibração, no qual o blastocisto intacto encolhe-se primeiro e então lentamente recargas a blastocoel, entrando em vitrificação com um blastocoel cheio de líquido. O blastocisto artificialmente recolhido permanece na sua fase encolhido pela fase de equilibração inteira. Durante a fase de vitrificação, ele também não altera seu volume. Desde que o blastocisto morfometria mostra um volume constante dos blastocistos artificialmente recolhidos durante a etapa de previtrification, parece que esta etapa pode ser mais curta. O protocolo descrito fornece muitos parâmetros comparativos adicionais de comportamento de blastocisto durante e após a criopreservação em função da velocidade e intensidade das variações do volume, o número de contrações blastocoel parcial ou total blastocisto colapsos e o tempo para um total de blastocoel re-expansão ou o tempo de incubação.
Introduction
Criopreservação de embriões humanos de pré-implantação do in vitro fertilização programa (FIV) hoje em dia é uma prática de rotina na maioria dos laboratórios de fertilização in vitro. O embrião lento congelando o método começou a ser utilizado clinicamente em 1985, com a introdução de crioprotectores específicos e congeladores controlado por computador, que permitiram o resfriamento controlado de embriões até-7 ° C, quando a nucleação de gelo (semeadura) foi induzida na circundante cryoprotective médio1. Por resfriamento contínuo, iria crescer cristais de gelo, causando a hiperosmolaridade da fração líquida restante e, consequentemente, a desidratação e contração das células embrionárias. A-30 ° C ou -80 ° C, os embriões que mergulhou o nitrogênio líquido para conservação mais longa. O que estava acontecendo com os embriões e oócitos durante o resfriamento podia ser observada apenas por cryomicroscopes especialmente adaptados, que ajudou a melhorar os protocolos de criopreservação2. O congelamento de blastocistos, um volume maior e mais fluido contido fase embrionária, deu resultados clínicos menos promissores naqueles dias3.
O grande avanço na criopreservação do blastocisto foi a introdução do método de vitrificação, em que a desidratação das células ocorreu antes de refrigeração usando altas concentrações de crioprotectores4. A remoção do fluido do blastocoel antes de vitrificação também pode ser conseguida fazendo uma abertura mecânica entre dois trofectoderma células5. Embora a taxa de sobrevivência de blastocisto imediata após a vitrificação e aquecimento está acima de 90% e os seguintes resultados clínicos a transferência de blastocisto vitrificados/aquecido na cavidade uterina é quase comparável aos resultados após a transferência do fresco embriões, esse método de criopreservação ainda não foi padronizada6,7. Protocolos de vitrificação variam de acordo com o tipo e a concentração dos crioprotectores, (b) o número de passos previtrification, (c) a duração das etapas individuais, (d) o uso de um blastocoel artificial em colapso antes de vitrificação, ou não, (e). colapso (g) a temperatura de equilíbrio/vitrificação, fase (f) a expansão de blastocisto e métodos em que os embriões devem ser vitrificados8. Desde crioprotectores podem ser tóxicos para as células, o tempo de exposição do blastocisto para essas soluções tem que ser bem definidos. No entanto, alguns fabricantes de mídia de criopreservação permitam protocolos muito flexíveis.
O interesse dos cientistas é geralmente focado em estudar a capacidade de re-expansão do blastocisto com o objectivo de encontrar novos biomarcadores com uma melhor previsão de implantação6,9,10. Como humanos blastocistos desidrata-se em diferentes etapas de adição de crioprotectores antes de vitrificação e o que acontece com blastocistos após a vitrificação e aquecimento, quando os crioprotectores têm ser retiradas as células, e como os blastocistos hidratar e re-expandir após o aquecimento, é não bem descrito nem compreendido. O desenvolvimento de uma metodologia para o objectivo e quantificados monitoramento do comportamento de blastocisto durante etapas diferentes de criopreservação é, portanto, lógica.
Com microscópios de lapso de tempo de vários fabricantes, agora é possível acompanhar o comportamento do blastocisto no pré e pós-vitrificação fases. Incluindo ferramentas de computador adicional, medições de seu tamanho (morfometria) também podem ser realizadas. Por medição a diminuição ou aumento no tamanho do embrião em um determinado momento, é possível objetivar a avaliação da morfodinâmica de embriões durante a desidratação e reidratação.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo para a observação de blastocisto morfodinâmica durante e após a criopreservação também pode ser realizada usando ferramentas de software de outros fabricantes e instrumentos semelhantes. Sistemas de lapso de tempo ajustados para embriologia permitem o monitoramento contínuo do desenvolvimento embrionário. O objetivo deste trabalho foi apresentar a quantificação do comportamento de blastocisto durante a preparação dos blastocistos para vitrificação e após o seu aquecimento. Isto foi feito a med…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é uma parte do programa P3-0327 e pesquisa projeto de pesquisa J3-7177, fundada pela Fundação de pesquisa do Esloveno.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Riferimenti
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