Morfometrisk protokol for en objektiv vurdering af Blastocyst adfærd under vitrifikation og opvarmning trin
Summary
Her præsenterer vi en time-lapse morfometrisk protokol for at følge intensiteten af blastocyst svind og re-udvidelse under previtrification interventioner og efter opvarmning opsving. Anvendelsen af protokollen er muligt i in vitro- befrugtning laboratorier udstyret med time-lapse mikroskoper og anbefales i udviklingen af en optimal blastocyst vitrifikation metode.
Abstract
I denne artikel beskrives metoden noninvasive af blastocyst morfometri baseret på time-lapse microphotography for nøjagtig overvågning af en blastocyst volumen ændre under enkelte faser før og efter vitrifikation. Metoden kan være nyttige i at søge efter den mest optimale timing af blastocyst eksponering for forskellige koncentrationer af cryoprotectants ved at observere blastocyst svind og re-ekspansion i forskellige pre og post vitrifikation faser. Med denne metode, kan blastocyst vitrifikation protokol optimeres. For et bedre bevis på nytten af denne morfometrisk metode sammenlignes to forskellige blastocyst forberedelse protokoller for forglasning; én med ved hjælp af en kunstig blastocoel kollapse og én uden denne intervention før vitrifikation. Både blastocyster volumen forandringer er efterfulgt af time-lapse microphotography og målt af fotoredigering softwareværktøjer. Målingerne er taget hver 20 sekunder i previtrification faser, og hver 5 minutter i perioden efter opvarmning. Ændringer af dimensionerne blastocyst pr. tidsenhed præsenteres grafisk i linje diagrammer. Resultaterne viser en lang ækvilibrering previtrification fase hvor intakt blastocyst først krymper og derefter langsomt påfyldninger blastocoel, indtastning vitrifikation med et væskefyldt blastocoel. Kunstigt kollapsede blastocyst forbliver i sin indskrumpet fase gennem hele ækvilibrering fase. Fasen vitrifikation ændrer det også ikke dens volumen. Da blastocyst morfometri viser et konstant volumen af de kunstigt kollapsede blastocyster under trinnet previtrification, synes det, at denne fase kunne være kortere. Den beskrevne protokol indeholder mange ekstra sammenlignende parametre af blastocyst adfærd under og efter kryopræservering på grundlag af den hastighed og intensitet af volumen ændringer, antallet af delvise blastocoel sammentrækninger eller samlede blastocyst kollapser, og tid til en total blastocoel re-udvidelse eller tid til at ruge.
Introduction
Kryopræservering af præimplantations menneskefostre fra in vitro- befrugtning programmet (IVF) er i dag en rutinemæssig praksis i de fleste IVF laboratorier. Langsom embryoet nedfrysning metode begyndte at være klinisk bruges i 1985, med indførelsen af særlige cryoprotectants og computer-kontrollerede frysere, som aktiveret de kontrolleret afkøling af embryoner ned til-7 ° C, når isen Nukleering (såning) blev induceret i den omkringliggende cryoprotective medium1. Ved kontinuerlig køling, iskrystallerne ville vokse, forårsager hyperosmolality af den resterende flydende fraktion og dermed dehydrering og svind af embryonale celler. På 30 ° C eller-80 ° C, embryoner vil blive kastet ud i de flydende kvælstof til længere opbevaring. Hvad der skete med embryoner eller oocyter under afkøling kunne overholdes kun af specielt tilpasset cryomicroscopes, som bidrog til at forbedre kryopræservering protokoller2. Indefrysning af blastocyster, en højere volumen og mere væske-indeholdt embryonale fase, gav mindre lovende kliniske resultater i disse dage3.
Gennembrud i kryopræservering af blastocyst var indførelsen af metoden vitrifikation, hvor dehydrering af cellerne fandt sted inden køling ved hjælp af høje koncentrationer af cryoprotectants4. Fjernelse af væske fra blastocoel før vitrifikation kan også opnås ved at gøre en mekanisk åbning mellem to trophectoderm celler5. Selv om den umiddelbare blastocyst overlevelsesrate efter vitrifikation og opvarmning er over 90%, og de kliniske resultater efter er overførsel af forglasset/varmet blastocyst i livmoderhulen næsten sammenlignes med resultater efter overførsel af frisk embryoner, kryopræservering metoden er endnu ikke blevet standardiseret6,7. Vitrifikation protokoller varierer efter a type og koncentration af cryoprotectants, (b) antallet af trin, previtrification, (c) varigheden af enkelte trin, (d) anvendelse af en kunstig blastocoel kollapse før vitrifikation eller ej, (e). kollapse metoder, (f) blastocyst ekspansion fase og (g) ækvilibrering/vitrifikation temperatur på som embryonerne skal være forglasset8. Da cryoprotectants kan være giftigt for celler, må blastocyst eksponeringstid til disse løsninger være veldefinerede. Men nogle kryopræservering medier producenter tillade meget fleksibel protokoller.
Interesse af forskere er normalt fokuseret på at studere blastocyst re-ekspansion evne med henblik på at finde nye biomarkører med en bedre forudsigelse af implantation6,9,10. Hvordan menneskelige blastocyster dehydrere på forskellige trin for at tilføje cryoprotectants før vitrifikation og hvad sker der med blastocyster efter vitrifikation og opvarmning, når cryoprotectants har at blive fjernet fra cellerne, og hvordan blastocyster rehydrere og re-udvide efter opvarmning, er ikke godt beskrevet eller forstået. Udvikling af en metodologi til målet og kvantificerede overvågning af blastocyst opførsel under forskellige kryopræservering trin er således rationale.
Med time-lapse mikroskoper af forskellige producenter er det nu muligt at overvåge adfærd i blastocyst i pre og post vitrifikation faser. Ved at inkludere yderligere edb-værktøjer, kan der også udføres målinger af deres størrelse (morfometri). Ved måling af fald eller en stigning i embryo størrelse på et givet tidspunkt, er det muligt at objektivere evaluering af morphodynamics af embryoner under dehydrering og rehydrering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol for observation af blastocyst morphodynamics under og efter kryopræservering kan også foretages ved hjælp af lignende instrumenter og softwareværktøjer fra andre producenter. Time-lapse systemer justeret for embryologi giver mulighed for løbende overvågning af embryo udvikling. Formålet med dette arbejde var at indføre kvantificering af blastocyst adfærd i forbindelse med udarbejdelsen af blastocyster for forglasning og efter deres opvarmning. Dette blev gjort ved den objektive måling af ændringer i …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er en del af programmet P3-0327 og forskning forskningsprojekt J3-7177, grundlagt af slovenske Research Foundation.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Riferimenti
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming – a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
