פרוטוקול Morphometric להערכה אובייקטיבית של הבלסטוציסט התנהגות במהלך ויטריפיקציה והשלבים התחממות כדור הארץ
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול זמן לשגות morphometric לעקוב האינטנסיביות של הבלסטוציסט התכווצות והתרחבות re במהלך התערבויות previtrification ושחזור פוסט-התחממות כדור הארץ. היישום של הפרוטוקול אפשרי במבחנה מעבדות הפריה מצויד מיקרוסקופים בצילום מואץ והוא מומלץ בפיתוח של שיטת ויטריפיקציה הבלסטוציסט אופטימלית.
Abstract
מאמר זה מתאר את השיטה לא פולשנית של הבלסטוציסט morphometry מבוסס על זמן לשגות microphotography עבור ניטור מדויק של אמצעי אחסון של הבלסטוציסט שינוי במהלך שלבים בודדים לפני ואחרי ויטריפיקציה. השיטה יכולה להיות שימושית בחיפוש אחר הזמן האופטימלי ביותר של חשיפה הבלסטוציסט ריכוזים שונים של cryoprotectants על ידי התבוננות הבלסטוציסט הצטמקות, re-הרחבה שונים מראש, שלאחר ויטריפיקציה שלבים. עם מתודולוגיה זו, ניתן למטב את פרוטוקול ויטריפיקציה הבלסטוציסט. לקבלת הדגמה טובה יותר של התועלת של שיטה זו morphometric, מושווים שני פרוטוקולים הכנה הבלסטוציסט שונים עבור ויטריפיקציה; אחד עם שימוש של blastocoel מלאכותיים כיווץ ואחד ללא התערבות זו לפני ויטריפיקציה. שניהם שינויי נפח של blastocysts ואחריו microphotography זמן לשגות, נמדדת כלי תוכנה לעריכת תמונות. המדידות נלקחים בכל 20 שניות בשלבים previtrification של כל 5 דקות בתקופה שלאחר התחממות כדור הארץ. השינויים של הממדים הבלסטוציסט ליחידת הזמן מוצגים בצורה גרפית בדיאגרמות קו. התוצאות מציגות שלב previtrification equilibration ארוך בו הבלסטוציסט ללא פגע קודם מכווץ, ואז לאט לאט מילוי blastocoel, הזנת ויטריפיקציה עם blastocoel מלאות נוזל. הבלסטוציסט המצומצם באופן מלאכותי נשארת בשלבי מכווצים באמצעות שלב equilibration כולו. במהלך שלב ויטריפיקציה, זה גם לא משנה הנפח שלה. מאז morphometry הבלסטוציסט מראה נפח קבוע של blastocysts באופן מלאכותי התמוטט במהלך השלב previtrification, נראה כי בשלב זה יכול להיות קצר יותר. פרוטוקול המתואר מספק פרמטרים רבים נוספים השוואתי בהתנהגות הבלסטוציסט במהלך ואחרי הקפאה קריוגנית על בסיס המהירות ואת עוצמת השינויים אמצעי האחסון, מספר ההתכווצויות blastocoel חלקית או מוחלטת הבלסטוציסט מכווץ, הזמן הכולל blastocoel re-הרחבה או זמן הבקיעה.
Introduction
הקפאה קריוגנית של עוברי של אדם מתוכנית במבחנה הפריה (IVF) היא כיום אימון שגרתי במעבדות IVF רוב. העובר איטי הקפאת שיטת החל להיות בשימוש קליני בשנת 1985, עם כניסתה של cryoprotectants ספציפיים ומקפיאים מבוקרת מחשב, שאיפשר הקירור מבוקרת של עוברי ל-7 מעלות צלזיוס, כאשר התגרענות קרח (זריעה) הושרה ב סביב cryoprotective בינוני1. על ידי קירור רציפה, יגדלו גבישי הקרח, גורם את hyperosmolality של השבר נוזלי הנותרים, וכתוצאה מכך להתייבשות, הצטמקות של תאים עובריים. למינוס 30 מעלות או-80 ° C, העוברים ההיסחפות לתוך החנקן הנוזלי לאחסון ארוך יותר. מה קורה עם עוברי או oocytes במהלך הקירור יכול להיות שנצפו רק על ידי הותאם במיוחד cryomicroscopes, אשר סייע לשפר הקפאה קריוגנית פרוטוקולים2. להקפאת blastocysts, נפח-גבוה יותר, בשלב העוברי הכיל-נוזל יותר, נתן פחות מבטיח תוצאות קליניות בימים האלה3.
פריצת הדרך ב הקפאה קריוגנית של הבלסטוציסט היה כניסתה של שיטת ויטריפיקציה, אשר להתייבשות של התאים התרחשה לפני קירור באמצעות ריכוזים גבוהים של cryoprotectants4. הסרת הנוזלים blastocoel לפני ויטריפיקציה גם יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע פתיחה מכנית בין trophectoderm שני תאים5. למרות שיעור ההישרדות של הבלסטוציסט מיידית לאחר ויטריפיקציה ומחמם הוא מעל 90%, ואת הבאות התוצאה הקלינית בהעברת הבלסטוציסט vitrified/חימם לתוך חלל הרחם הוא כמעט להשוות תוצאות לאחר ההעברה של טרי עוברי, שיטה זו הקפאה קריוגנית טרם בוטלה מתוקננת6,7. ויטריפיקציה פרוטוקולים משתנים בהתאם ריכוז cryoprotectants, (ב) מספר צעדים previtrification, (ג) משך הזמן של צעדים בודדים, (ד) שימוש blastocoel מלאכותי כיווץ לפני ויטריפיקציה או לא, וסוג (א) (e). קורס שיטות (נ) הרחבת הבלסטוציסט הבמה, (g) הטמפרטורה equilibration/ויטריפיקציה ב. שאמור להיות העוברים vitrified8. מאז cryoprotectants יכול להיות רעיל עבור תאים, זמן חשיפה הבלסטוציסט פתרונות אלו חייב להיות מוגדרת היטב. עם זאת, חלק מיצרני מדיה הקפאה קריוגנית לאפשר פרוטוקולים מאוד גמיש.
האינטרס של מדענים מתמקדת בדרך כלל לימוד היכולת re-הרחבת הבלסטוציסט במטרה למצוא סמנים ביולוגיים חדש עם חיזוי טוב יותר של ההשתלה6,9,10. איך blastocysts האנושי מייבשים-שלבים שונים של הוספת cryoprotectants לפני ויטריפיקציה, מה קורה עם blastocysts לאחר ויטריפיקציה ומחמם, כאשר cryoprotectants יש להסיר את התאים, איך להחזיר blastocysts נוזלים, להרחיב מחדש לאחר התחממות כדור הארץ, הוא לא היטיב לתאר ולא מובן. פיתוח מתודולוגיה המטרה וניטור כימות של הבלסטוציסט התנהגות במהלך שלבים שונים הקפאה קריוגנית היא, לפיכך, הרציונל.
עם מיקרוסקופים בצילום מואץ של יצרנים שונים, עכשיו זה אפשרי לנטר את ההתנהגות של הבלסטוציסט ב טרום ואת פוסט-ויטריפיקציה שלבים. על-ידי הכללת מחשב נוסף כלים, מדידות של גודלם (morphometry) ניתן גם לבצע. על ידי מדידת הירידה או להגביר את גודל העובר בזמן נתון, ניתן לבחון את ההערכה של morphodynamics של העוברים במהלך התייבשות, התייבשות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול עבור התצפית של הבלסטוציסט morphodynamics במהלך ואחרי הקפאה קריוגנית יכול גם להתבצע באמצעות כלים דומים וכלי תוכנה של יצרנים אחרים. מערכות זמן לשגות מותאם אמבריולוגיה מאפשרות ניטור רציף של התפתחות העובר. מטרת עבודה זו היתה להציג כימות של הבלסטוציסט התנהגות במהלך הכנת blastocysts עבור ויטריפ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היא חלק מפרויקט מחקר תוכנית P3-0327 ומחקר J3-7177, נוסד על ידי קרן המחקר הסלובני.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Riferimenti
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming – a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
