Морфометрические протокол для объективной оценки бластоциста поведения во время стеклования и потепления шаги
Summary
Здесь мы представляем покадровой морфометрические протокол следовать интенсивность бластоциста усадки и ре расширение во время previtrification вмешательства и после потепления восстановления. Применение протокола возможен в в пробирке оплодотворение лаборатории, оснащенные покадровой Микроскопы и рекомендуется в разработке оптимальной бластоциста витрификации метода.
Abstract
Эта статья описывает метод неинвазивной бластоциста морфометрия, основанные на промежуток времени микрофотографирование для точного мониторинга бластоциста тома меняется на отдельных этапах до и после витрификации. Метод может быть полезным в поисках наиболее оптимальных сроках бластоциста воздействия различных концентрациями криопротекторов, наблюдая бластоциста усадки и ре расширение в различных до и после витрификации фазы. С этой методологией протокол витрификации бластоцисты могут быть оптимизированы. Для лучшей демонстрации полезности этого метода морфометрических сравниваются два разных бластоциста подготовка протоколов для витрификации; один с использованием искусственных blastocoel рушится и один без этого вмешательства до витрификации. Оба изменения объема бластоцисты следуют промежуток времени микрофотографирование и измеряется инструменты для редактирования фотографий программного обеспечения. Измерения проводятся каждые 20 секунд в previtrification фаз и каждые 5 минут в период после потепления. В линии диаграммы графически представлены изменения размеров бластоциста за единицу времени. Результаты показывают фазы previtrification длинный уравновешивания, в котором нетронутыми бластоциста сначала сжимается и затем медленно заправки blastocoel, введя стеклования с blastocoel, заполненные жидкостью. Искусственно рухнул бластоциста остается в стадии усохшие через весь уравновешивания фазу. Во время этапа витрификации он также не изменяет его объем. Так как бластоциста морфометрия показывает постоянный объем искусственно рухнул бластоцист на этапе previtrification, кажется, что этот этап может быть короче. Описывается протокол предоставляет множество дополнительных сравнительных параметров бластоциста поведения во время и после криоконсервирования на основе скорости и интенсивности изменений объема, количество частичной blastocoel схватки или всего бластоцисты рушится и время для всего blastocoel re расширению или время для штриховки.
Introduction
Криоконсервация эмбрионов человека Предимплантационная от в vitro программы оплодотворения (IVF) является в настоящее время обычной практикой в большинстве лабораторий Эко. Медленно эмбриона замораживания метод начал клинически использоваться в 1985 году, с введением конкретных криопротекторов и компьютерным управлением морозильных камер, которые позволили контролируемого охлаждения эмбрионов до-7 ° C, когда вызывали нуклеации льда (посев) окружающие криозащитных средних1. Путем непрерывного охлаждения, будут расти кристаллы льда, вызывая hyperosmolality оставшиеся жидкой фракции и, следовательно, обезвоживания и усадки эмбриональных клеток. При-30 ° C или ° C-80 эмбрионы будет ввергнута в жидкого азота для более длительного хранения. Что происходит с яйцеклеток или эмбрионов во время охлаждения можно наблюдать только в специально адаптированных cryomicroscopes, который помог улучшить криоконсервирования протоколы2. Замораживание бластоцисты, больший объем и более жидкости содержатся эмбриональной стадии, дал менее перспективным клинические результаты в эти дни3.
Прорыв в криоконсервирования бластоциста было введение витрификации метода, в котором обезвоживания клеток имела место до охлаждения с помощью высоких концентраций криопротектора4. Удаления жидкости из blastocoel до стеклования можно также добиться путем механического открытия между двумя трофоэктодерму клетки5. Хотя непосредственной бластоциста выживаемость после витрификации и потепление выше 90% и после клинических исходов передачи стеклообразное/утепленные бластоцисты в полость матки почти сопоставимо с результаты после передачи свежих эмбрионов, этот метод криоконсервирования еще не стандартизированных6,7. Витрификация протоколы зависимости (типа и концентрации криопротектора, (b количество previtrification шагов, (c) продолжительность отдельных шагов, (d) использование искусственного blastocoel, рушится перед витрификации или нет, (e). рушится на котором эмбрионы должны быть методы, стадии бластоцисты расширения (f) и (g) температура уравновешивания/витрификации стеклообразное8. Так как криопротекторов могут быть токсичны для клеток, время экспозиции бластоциста этих решений имеет быть четко определены. Однако некоторые производители криоконсервирования СМИ позволяют очень гибкие протоколы.
Интерес ученых обычно сосредоточена на изучении бластоциста ре расширение способности с целью найти нового биомаркерами с лучше прогноз имплантации6,9,10. Как человека бластоцисты обезвоживают на различные этапы добавления криопротекторов перед витрификация и что происходит с бластоцисты после витрификации и потепления, когда криопротекторов должны быть удалены из клетки, и как бластоцисты увлажняет и повторно разверните после потепления, не очень хорошо описал не понял. Таким образом, обоснование является разработка методологии для цели и количественных мониторинг бластоциста поведения во время различных криоконсервирования шаги.
С покадровой Микроскопы различных производителей это теперь возможно контролировать поведение бластоцисты в до и после витрификации фазы. Включив дополнительные компьютерные инструменты, могут также выполняться измерения их размера (морфометрия). Измерении уменьшение или увеличение размера эмбриона на данный момент, это позволяет объективизировать оценки morphodynamics эмбрионов во время обезвоживания и регидратации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол для наблюдения бластоциста morphodynamics во время и после криоконсервирования также может осуществляться с помощью аналогичных инструментов и программных средств от других производителей. Промежуток времени системы, скорректированные с учетом эмбриологии позволяют непрерывный …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа является частью исследовательской программы P3-0327 и исследовательского проекта J3-7177, основанная в Словенский исследовательский фонд.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Riferimenti
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming – a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
