Morfometriska protokoll för objektiva bedömning av blastocysten beteende vid förglasning och värmande steg
Summary
Här presenterar vi en time-lapse morfometriska protokoll att följa intensiteten av blastocysten krympning och re-expansion under previtrification insatser och efter uppvärmningen återhämtning. Tillämpningen av protokollet är möjligt i in vitro- fertilisering laboratorier som är utrustade med time-lapse Mikroskop och rekommenderas i utvecklingen av en optimal blastocysten förglasning metod.
Abstract
Denna artikel beskriver den icke-invasiva metoden för blastocyst morfometri baserat på time-lapse microphotography för exakt övervakning av blastocyst’s volym ändra under enskilda faserna före och efter förglasning. Metoden kan vara användbar i sökandet efter den mest optimala tidpunkten blastocysten exponering för olika koncentrationer av cryoprotectants genom att observera blastocysten krympning och re-expansion i olika före och efter förglasning faser. Med denna metod, kan det blastocystan förglasning protokollet optimeras. För en bättre demonstration av nyttan av denna morfometriska metod jämförs två olika blastocysten förberedelse protokoll för förglasning. en med hjälp av en konstgjord blastocoel kollapsar och en utan detta ingripande innan förglasning. Både blastocyster volymförändringar följs av time-lapse microphotography och mätt med fotoredigering verktyg. De mätningarna var 20 sekund i previtrification faser och var femte minut under perioden efter uppvärmningen. Ändringarna av de blastocystan dimensionerna per tidsenhet presenteras grafiskt linje diagram. Resultaten visar en lång Jämviktstiden previtrification fas där intakt blastocysten först krymper och sedan långsamt påfyllnad av blastocoel, in förglasning med en vätskefylld blastocoel. Artificiellt kollapsade blastocysten förblir i sin krympta steg genom hela Jämviktstiden fas. Under förglasning fas ändra det också inte dess volym. Eftersom den blastocystan morfometri visar konstant volym av de artificiellt kollapsade blastocyster under previtrification steg, verkar det som detta skede kunde vara kortare. Protokollet beskrivs ger många ytterligare jämförande parametrar av blastocysten beteende under och efter frysförvaring på grundval av hastighet och intensitet av volymändringar, antalet partiella blastocoel sammandragningar eller totala blastocysten kollapsar, och tid att en total blastocoel re-expansion eller tiden till kläckning.
Introduction
Frysförvaring av embryon preimplantatorisk från in vitro- fertilisering programmet (IVF) är numera en rutinmässig praxis i de flesta IVF laboratorier. Långsam embryot frysa metoden började användas kliniskt 1985, med införandet av särskilda cryoprotectants och datorstyrda frysar, vilket möjliggjorde kontrollerad kylning av embryon ner till-7 ° C, när is kärnbildning (sådd) var induceras i den omgivande cryoprotective medium1. Genom kontinuerlig kylning, iskristallerna skulle växa, orsakar hyperosmolality av den återstående flytande fraktionen och, följaktligen, uttorkning och krympning av embryonala celler. Vid-30 ° C eller -80 ° C, embryon skulle vara störtade ner i det flytande kvävgasen för längre lagring. Vad hände med embryon eller oocyter under kylningen kan observeras endast av specialanpassade cryomicroscopes, som bidrog till att förbättra frysförvaring protokoll2. Frysning av blastocyster, en högre volymer och mer vätska-innehöll fosterstadium, gav mindre lovande kliniska resultat i dessa dagar3.
Genombrottet i Frysförvaring av blastocystan var införandet av metoden förglasning, där uttorkningen av cellerna ägde rum före kylning med hjälp av höga koncentrationer av cryoprotectants4. Avlägsnande av vätskan från blastocoel innan förglasning kan också uppnås genom att göra en mekanisk öppning mellan två trophectoderm celler5. Även om omedelbar blastocysten överlevnaden efter förglasning och uppvärmningen är över 90%, och kliniska resultatet följande är överföring av förglasad/värmde blastocysten in i livmoderhålan nästan jämförbar med resultat efter överföringen av färska embryon, frysförvaring metoden har ännu inte standardiserad6,7. Förglasning protokoll variera enligt (a) typ och koncentration av cryoprotectants, (b) antal previtrification steg, (c) varaktigheten av enskilda steg, (d) användning av en konstgjord blastocoel kollapsa innan förglasning eller inte, (e). kollapsa metoder, (f) den blastocyst expansionen scenen och (g) Jämviktstiden/förglasning temperaturen på vilket embryon bör förglasat8. Eftersom cryoprotectants kan vara giftiga för celler, måste den blastocyst exponeringstiden till dessa lösningar definieras väl. Dock tillåta vissa frysförvaring media tillverkare mycket flexibelt protokoll.
Av intresse för forskare är oftast fokuserat på att studera den blastocystan re-expansion förmågan med syftet att finna nya biomarkörer med en bättre förutsägelse av implantation6,9,10. Hur mänskliga blastocyster torka på olika steg för att lägga till cryoprotectants innan förglasning och vad händer med blastocyster efter förglasning och uppvärmningen, när cryoprotectants har tagits bort från cellerna och hur blastocyster rehydrera och åter expandera efter uppvärmningen, är inte väl beskrivna heller förstås. Utveckling av en metod för målet och kvantifierade övervakning av blastocysten beteende under olika frysförvaring steg är således logiken.
Med time-lapse Mikroskop av olika tillverkare är det nu möjligt att övervaka beteendet hos blastocystan i före och efter förglasning faser. Genom att inkludera ytterligare datorverktyg, kan mätningar av deras storlek (morfometri) också utföras. Genom att mäta minskningen eller öka i embryo storlek vid en given tidpunkt, det är möjligt att objektifiera utvärdering av morphodynamics av embryon under Dehydrering och rehydrering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet för observation av blastocysten morphodynamics under och efter frysförvaring kan också utföras med hjälp av liknande instrument och verktyg från andra tillverkare. Time-lapse system justerat för embryologi tillåter kontinuerlig övervakning av embryots utveckling. Syftet med detta arbete var att införa kvantifiering av blastocysten beteende under utarbetandet av blastocyster för förglasning och efter sin uppvärmning. Detta skedde genom objektiva mätningen av förändringar i morfologi på en tids…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete är en del av programmet-P3-0327 och forskning forskningsprojektet J3-7177, grundades av den slovenska Research Foundation.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Riferimenti
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming – a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
