Blastosist davranış objektif değerlendirme Vitrifiye ve ısınma adımları sırasında için xarakteristikaları Protokolü
Summary
Burada blastosist büzülme ve re-Genleşme yoğunluğunu previtrification müdahaleler sonrası ısınma kurtarma sırasında takip etmek ve hızlandırılmış xarakteristikaları iletişim kuralı mevcut. Uygulama Protokolü’nün in vitro fertilizasyon Laboratuvarları ile hızlandırılmış mikroskoplar donatılmış mümkündür ve bir en iyi blastosist vitrifikasyon yöntemi gelişiminde önerilir.
Abstract
Bu makalede önce ve sonra vitrifikasyon bireysel aşamaları sırasında değişen bir blastosist’ın biriminin doğru izleme için hızlandırılmış Mikrofotoğrafi dayalı blastosist morfometri noninvaziv yöntem. Yönteminin blastosist maruz kalma cryoprotectants farklı konsantrasyonlarda en uygun zamanlaması için blastosist büzülme ve re-genişleme farklı öncesi ve sonrası vitrifikasyon aşamaları gözlemleyerek aramada kullanışlı olabilir. Bu metodoloji ile blastosist vitrifikasyon Protokolü getirilebilir. Bu xarakteristikaları yöntem kullanışlılığı daha iyi bir gösteri için iki farklı blastokist hazırlığı protokol vitrifikasyon için karşılaştırılır; çöken bir yapay blastocoel kullanarak ve bu araya vitrifikasyon önce. Hem blastokistlerin cilt değişiklikleri tarafından hızlandırılmış Mikrofotoğrafi takip ve fotoğraf düzenleme yazılımı araçları tarafından ölçülür. Ölçümler her 20 saniyede previtrification aşamasında ve her 5 dakikada sonrası ısınma döneminde alınır. Değişiklikleri zaman birimi başına blastosist boyutlarının satır diyagramlarında grafik olarak sunulmaktadır. Sonuçlar sağlam blastosist ilk küçülür ve sonra yavaş yavaş yenilenir vitrifikasyon ile sıvı dolu blastocoel giren blastocoel, bir uzun denge previtrification faz gösterir. Yapay olarak daraltılmış blastosist küçültülmüş sahne tüm denge faz üzerinden kalır. Vitrifiye aşamasında hacmi de değişmez. Blastosist morfometri yapay olarak daraltılmış blastokistlerin sürekli hacmini previtrification adımı sırasında gösterir, bu bu aşamada daha kısa olabilir görünüyor. Açıklanan protokol sırasında ve sonrasında dondurma hız ve yoğunluk birim değişiklikleri, kısmi blastocoel kasılmalar veya toplam blastosist sayısı temelinde blastosist davranış birçok ek karşılaştırmalı parametreleri sağlar çöker ve bir toplam blastocoel re-genişleme vakti veya tarama için tam zamanı.
Introduction
Vitro fertilizasyon programından (IVF) insan Preimplantasyon embriyo dondurma günümüzde çoğu IVF Laboratuvarı rutin bir uygulamadır. Yavaş embriyo dondurma yöntemi belirli cryoprotectants ve buz çekirdekleşme (tohum) içinde akımıdır zaman kontrollü embriyo-7 ° C, aşağı soğutma etkin bilgisayar kontrollü Dondurucular getirilmesi ile 1985 yılında klinik olarak kullanılmaya başlandı cryoprotective orta1çevreleyen. Sürekli soğutma tarafından buz kristalleri, hyperosmolality kalan sıvı kesir ve sonuç olarak, dehidrasyon neden büyüyecek ve büzülme embriyonik hücreleri. -30 ° C ya da-80 ° C de, embriyolar daha uzun depolama için sıvı azot içine daldı. Embriyo veya yumurta ile soğutma sırasında neler olduğunu dondurma iletişim kuralları2geliştirmeye yardımcı olan sadece özel olarak tasarlanmış cryomicroscopes tarafından gözlenen. Blastokistlerin, yüksek hacimli ve daha fazla sıvı bulunan embriyonik evre dondurulması daha az umut verici klinik sonuçlar o gün3‘ te verdi.
Giriş hangi hücreleri susuzluktan cryoprotectants4yüksek konsantrasyonda kullanarak soğutma önce gerçekleşti vitrifikasyon yönteminin blastosist dondurma içinde adımdı. Vitrifiye önce blastocoel sıvısını kaldırılması da mekanik açma iki trophectoderm hücreleri5arasında yaparak elde edilebilir. Vitrifiye ve ısınma sonra hemen blastosist sağkalım oranı % 90 ve klinik sonuç aşağıdaki olmasına rağmen Vitrifiye/ısındı blastosist transferi uterin kavite içine taze transferden sonra sonuçları için neredeyse karşılaştırılabilir embriyo, bu dondurma yöntemi henüz gelmedi standart6,7. Vitrifiye protokolleri (a) türü ve konsantrasyon cryoprotectants, (b) previtrification adım sayısını (c) tek tek adımları, (d) ya da değil daha önce vitrifikasyon çöken bir yapay blastocoel kullanımı süresince göre değişir, (e). yöntemleri, (f) blastosist genişleme sahne ve (g) denge/vitrifikasyon sıcaklık embriyo olmalıdır çöken8Vitrifiye. Cryoprotectants hücreler için toksik olabilir bu yana, iyi tanımlanmış blastosist pozlama süresi için bu çözümleri vardır. Ancak, bazı dondurma medya üreticileri çok esnek iletişim kurallarına izin ver.
Bilim adamları ilgi genellikle blastosist re-Genleşme yetenek yeni biyolojik ile daha iyi bir tahmin implantasyon6,9,10bulmak amacı ile çalışmaya odaklanmıştır. Vitrifiye ve Vitrifiye ve ısınma sonra blastokistlerin ile ne olur önce cryoprotectants ekleme farklı adımlar insan blastokistlerin kurutmak, ne zaman cryoprotectants var hücreleri, ve nasıl blastokistlerin suyla temasa kaldırılacak ve Isınma sonra yeniden genişletin, değil de açıklanan ne de anladım. Amaç için bir metodoloji geliştirilmesi ve quantified blastosist davranışını farklı dondurma adımları sırasında izleme, böylece, mantığı olduğunu.
İle hızlandırılmış mikroskoplar çeşitli üreticilerin, şimdi sonrası vitrifikasyon aşamaları ve öncesi içinde blastosist davranışını izlemek mümkündür. Ek bilgisayar araçları dahil ederek, onların büyüklük (morfometri) ölçümleri da gerçekleştirilebilir. Tarafından azalma ölçüm veya belirli bir zamanda embriyo Boyutu’nda artırın morphodynamics embriyo değerlendirilmesi sırasında su kaybı ve rehydration somutlaştırmak mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
İletişim kuralı gözlem altında blastosist morphodynamics sırasında ve sonra dondurma da benzer aletler ve diğer üreticilerin yazılım araçları kullanılarak yapılabilir. Hızlandırılmış sistemleri Embriyoloji için ayarlanabilir sürekli embriyo gelişimi izleme izin verir. Bu çalışmanın amacı blastosist davranış miktar Vitrifiye ve onların ısınma sonra blastokistlerin hazırlanması sırasında tanıtmak oldu. Bu kara delik bir zaman ölçeği üzerindeki değişiklikleri nesnel ölçümü tar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser araştırma programı P3-0327 ve araştırma projesi J3-7177, Sloven Araştırma Vakfı tarafından kurulan bir parçasıdır.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Riferimenti
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming – a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
