Morphometric protokollen for objektiv vurdering av blastocysten oppførsel under vitrifikasjon og oppvarming skritt
Summary
Her presenterer vi en time-lapse morphometric protokoll for å følge intensiteten av blastocysten krymping og re-utvidelse under previtrification intervensjoner og etter oppvarming utvinning. Anvendelsen av protokollen er mulig i i vitro fertilisering laboratorier utstyrt med time-lapse mikroskop og anbefales i utviklingen av en optimal blastocysten vitrifikasjon metode.
Abstract
Denne artikkelen beskriver den noninvasive metoden av blastocysten morphometry basert på time-lapse Mikrofotografering for nøyaktig overvåking av en blastocyst volum endre individuelle faser før og etter vitrifikasjon. Metoden kan være nyttig i å søke etter det mest optimale tidspunktet for blastocysten eksponering for ulike konsentrasjoner av cryoprotectants ved å observere blastocysten krymping og re-utvidelse i ulike pre og post vitrifikasjon faser. Med denne metodikken, kan blastocysten vitrifikasjon protokollen optimaliseres. For en bedre demonstrasjon av nytten av denne morphometric metoden sammenlignes to forskjellige blastocysten forberedelse protokoller for vitrifikasjon; en bruker en kunstig blastocoel kollapset og en uten denne intervensjonen før vitrifikasjon. Begge blastocysts’ endres blir etterfulgt av time-lapse Mikrofotografering og av foto-redigering verktøy. Målingene hentes hver 20 sekunder i previtrification faser og hver 5 minutter etter oppvarming perioden. Endringene av blastocysten dimensjonene per tidsenhet presenteres grafisk i linje diagrammer. Resultatene viser en lang balanse previtrification fase der intakt blastocysten først krymper og deretter sakte påfyll blastocoel, angi vitrifikasjon med en væskefylte blastocoel. Kunstig skjult blastocysten forblir i sin krympet scenen hele balanse fasen. I fasen for vitrifikasjon også endres ikke volumet. Siden blastocysten morphometry viser et konstant antall kunstig skjulte blastocysts under previtrification trinnet, synes det at dette stadiet kan være kortere. Beskrevet protokollen gir mange sammenlignende tilleggsparametere blastocysten oppførsel under og etter kryonisk bevaring på grunnlag av hastigheten og intensiteten av endres, delvis blastocoel sammentrekninger eller totale blastocysten kollapser, og tid til en totalt blastocoel re-utvidelse eller tid til å klekking.
Introduction
Kryonisk bevaring av menneskelig preimplantation embryoer fra i vitro fertilisering programmet (IVF) er i dag en rutinen praksis i de fleste IVF laboratorier. Langsom embryoet frysing metoden begynte for klinisk bruk i 1985, med innføringen av spesifikke cryoprotectants og datastyrt frysere, som aktivert kontrollert kjøling av embryo ned til-7 ° C, når isen nucleation (såing) ble indusert i den rundt cryoprotective middels1. Ved kontinuerlig kjøling, iskrystallene ville vokse, forårsaker hyperosmolality av gjenværende flytende brøken og følgelig dehydrering og krymping av embryonale celler. På 30 ° C eller-80 ° C, ville embryoene bli kastet inn i flytende nitrogen for lengre lagring. Hva skjedde med embryo eller oocytes under nedkjøling kunne observeres av spesialtilpassede cryomicroscopes, som bidro til å forbedre kryonisk bevaring protokoller2. Frysing av blastocysts, en høyere volum og mer væske-inneholdt gryende scenen, ga mindre lovende kliniske resultater i disse dager3.
Gjennombrudd i kryonisk bevaring av blastocysten var innføringen av metoden vitrifikasjon der dehydrering cellene fant sted før du kjøler deg ved hjelp av høye konsentrasjoner av cryoprotectants4. Fjerning av væsken fra blastocoel før vitrifikasjon kan også oppnås ved å gjøre en mekanisk åpningen mellom to trophectoderm celler5. Selv om umiddelbar blastocysten etter vitrifikasjon og oppvarming er over 90%, og kliniske utfallet følgende er overføring av vitrified/varmet blastocysten inn i livmor hulrom nesten sammenlignes med resultater etter overføring av frisk embryo, denne kryonisk bevaring metoden har ennå ikke er standardisert6,7. Vitrifikasjon protokoller variere med (a) type og konsentrasjonen av cryoprotectants, (b) antallet previtrification trinn (c) varigheten av individuelle stegene, (d) bruken av en kunstig blastocoel kollapset før vitrifikasjon eller ikke, (e). skjule metoder og (f) utvidelsen blastocysten scenen (g) balanse/vitrifikasjon temperaturen på som embryoene skal vitrified8. Siden cryoprotectants kan være giftig for celler, må eksponeringstid blastocysten å disse løsningene være godt definert. Men tillater noen kryonisk bevaring medier produsenter svært fleksibel protokoller.
Interessen for forskere er vanligvis fokusert på å studere blastocysten re utvidelse evnen med sikte på å finne nye biomarkers med en bedre forutsigelse av implantasjon6,9,10. Hvordan menneskelige blastocysts tørke i forskjellige trinn for å legge cryoprotectants før vitrifikasjon og hva skjer med blastocysts etter vitrifikasjon og oppvarming, når cryoprotectants må fjernes fra cellene, og hvordan blastocysts rehydrate og å utvide etter oppvarming, er ikke godt beskrevet eller forstått. Utvikling av en metode for målsettingen og kvantifisert overvåking av blastocysten atferd i ulike kryonisk bevaring trinnene er dermed begrunnelsen.
Med time-lapse mikroskoper av forskjellige produsenter er det nå mulig å overvåke oppførsel av blastocysten i pre og post vitrifikasjon faser. Ved ytterligere dataverktøy, kan målinger av sin størrelse (morphometry) også utføres. Ved måling reduksjon eller øke i fosteret størrelse på et gitt tidspunkt, er det mulig å objectify evaluering av morphodynamics av embryo dehydrering og rehydrering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen for observasjon av blastocysten morphodynamics under og etter kryonisk bevaring kan også utføres ved hjelp av lignende instrumenter og verktøy fra andre produsenter. Time-lapse systemer justert for embryologi tillater kontinuerlig overvåking av embryo utvikling. Hensikten med verket var å introdusere kvantifisering av blastocysten oppførsel under utarbeidelsen av blastocysts vitrifikasjon og etter deres oppvarming. Dette ble gjort av objektiv måling av endringer i morfologi på en tidsskala. Innhentet …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er en del av programmet P3-0327 og forskning forskningsprosjekt J3-7177, grunnlagt av den slovenske Research Foundation.
Materials
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Riferimenti
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming – a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
