Qui, presentiamo un protocollo per la visualizzazione, il rilevamento, l'analisi e il monitoraggio del traffico di mRNA endogeno nel vivo Drosophila melanogaster camera d'uovo utilizzando fari molecolari, microscopia confocale del disco rotante, e analisi open-source software.
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Articolo metodologico
Visualizzazione e monitoraggio di mRNA endogeni nelle camere uovo di Drosophila melanogaster dal vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le tecniche di imaging basate sulla fluorescenza, in combinazione con gli sviluppi della microscopia luminosa, hanno rivoluzionato il modo in cui i biologi cellulari conducono studi di imaging a cellule vive. I metodi per rilevare gli RNA si sono notevolmente espansi a partire dagli studi seminali collegati alla localizzazione dell'mRNA specifico del sito alla regolazione dell'espressione genica. I processi dinamici dell'mRNA possono ora essere visualizzati tramite approcci che rilevano gli mRNA, associati a set-up di microscopia abbastanza veloci da catturare la gamma dinamica del comportamento molecolare. La tecnologia dei fari molecolari è un approccio basato sull'ibridazione in grado di rilevare direttamente le trascrizioni endogene nelle cellule viventi. I fari molecolari sono sonde di acido nucleico a forma di tornante, accoltellato internamente, mononucleotide, che fluoresce solo dall'ibridazione in una sequenza bersaglio unica. Quando accoppiati con la microscopia a fluorescenza avanzata e l'imaging ad alta risoluzione, consentono di eseguire il monitoraggio spaziale e temporale del movimento intracellulare degli mRNA. Anche se questa tecnologia è l'unico metodo in grado di rilevare le trascrizioni endogene, i biologi cellulari non hanno ancora pienamente abbracciato questa tecnologia a causa delle difficoltà nella progettazione di tali sonde per l'imaging delle cellule vive. Una nuova applicazione software, PinMol, consente una progettazione avanzata e rapida delle sonde più adatte per ibridarsi in modo efficiente alle regioni bersaglio mRNA all'interno di una cellula vivente. Inoltre, l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e in tempo reale e l'attuale software di analisi delle immagini open source consentono un output di dati raffinato, portando a una valutazione più fine della complessità alla base dei processi dinamici coinvolti nel ciclo di vita del mRNA.
Qui presentiamo un protocollo completo per la progettazione e la consegna di fari molecolari nelle camere d'uovo della Drosophila melanogaster. Il rilevamento e la visualizzazione diretta e altamente specifica di mRNA materni endogeni avviene tramite la microscopia confocale del disco rotante. I dati di imaging vengono elaborati e analizzati utilizzando il rilevamento e il rilevamento degli oggetti nel software Icy per ottenere dettagli sul movimento dinamico degli mRNA, che vengono trasportati e localizzati in regioni specializzate all'interno dell'oocito.
Introduzione
Gli studi di biologia cellulare che visualizzano eventi dinamici con risoluzione spaziale e temporale sono stati resi possibili dallo sviluppo di tecniche di imaging delle cellule vive basate sulla fluorescenza. Attualmente, la visualizzazione mRNA in vivo si ottiene tramite tecnologie che si basano su interazioni RNA aptamer-proteina, fluorescenza indotta dall'RNA di coloranti organici e sonda dell'acido nucleico annealing1,2, 3. Tutti offrono un'elevata specificità, sensibilità e rapporto segnale-sfondo. Tuttavia, gli approcci centrati sull'RNA aptamer richiedono u....
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Protocollo
1. Progettazione di MB per Live Cell Imaging
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Piegare la sequenza di RNA bersaglio per prevedere la struttura secondaria del bersaglio mRNA utilizzando la "forma RNA" dal server mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- Incollare/caricare la sequenza di destinazione in formato FASTA, selezionare 5 o 10% di sub-optimality (strutture con un'energia libera di ripiegamento entro il 5 o 10% del valore MFE, rispettivamente) e regolare il numero massimo di pieghe calcolate di conseguenza (ad es. più grande per il 10% sub-ottimalità).
Nota: l'inclusione di strutture secondarie non ottimali durante la prog....
- Incollare/caricare la sequenza di destinazione in formato FASTA, selezionare 5 o 10% di sub-optimality (strutture con un'energia libera di ripiegamento entro il 5 o 10% del valore MFE, rispettivamente) e regolare il numero massimo di pieghe calcolate di conseguenza (ad es. più grande per il 10% sub-ottimalità).
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Risultati
Utilizzando PinMol, diversi MB possono essere progettati per un bersaglio mRNA (Figura 1B-C). Dopo la sintesi e la purificazione, i MB selezionati vengono caratterizzati e confrontati mediante l'analisi in vitro.
Figura 1: Tecnica e descrizione dei tessuti per l'imaging di cellule vi.......
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Discussione
La visualizzazione dal vivo del traffico endogeno di mRNA nelle camere delle uova della Drosophila si basa sull'uso di MB specifici, efficienti e resistenti alla nucasiera, che ora possono essere facilmente progettati con il software PinMol. Gli MB sono sonde specifiche progettate per rilevare sequenze univoche all'interno di un mRNA bersaglio (preferibilmente regioni prive di struttura secondaria), rendendo possibile il rilevamento altamente risolto di una trascrizione. L'unica limitazione quando si ad.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) per la sintesi, l'etichettatura e la purificazione dei fari molecolari, e Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, Università di Cambridge) per l'oskar-MS2/ Stock di mosca transgenico MCP-GFP. Questo lavoro è stato sostenuto da un National Science Foundation CAREER Award 1149738 e da un Professional Staff Congress-CUNY Award al DPB.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Spettrofluorimetro | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Spettrofluorimetro per conteggio di fotoni |
| Cuvetta al quarzo | Fireflysci (ex Precision Cells Inc.) | Pinzetta 701MFL | |
| Dumont #5 | World Precision Instruments | 501985 | Le pinzette sottili sono molto importanti per separare le singole camere delle uova |
| Olio di alocarburi 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Vetrino coprioggetto n. 1 22 mm x 40 mm | VWR | 48393-048 | |
| Microscopio da dissezione | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 cuscinetto per anestesia per moscerino della frutta | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH 7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Microscopio | confocale a disco rotanteMicroscopio invertito Leica DMI-4000B equipaggiato con disco rotante Yokogawa CSU 10 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 Telecamera ImagEM EMCCD | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipolatore | Eppendorf Inc. | ||
| Microiniettore FemtoJet | Eppendorf Inc. | ||
| Ago per iniezione: Femtotips II | Eppendorf Inc. | ||
| Suggerimento per il caricamento: 20 μ L Microloader | Eppendorf Inc. | ||
| Occhiali Micro Cover n. 1 o 1,5, 22 mm x 40 mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Lievito secco | Qualsiasi negozio di alimentari | n/a | |
| Computer, > 20 GB di RAM | Sebbene l'elaborazione possa essere eseguita sulla maggior parte dei computer, capacità più elevate aumenteranno la velocità di elaborazione |
Riferimenti
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11
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Ristampe e permessi
