인간 폐 조직에서 ZW10 상호 작용 단백질의 면역 염색의 디지털 분석
1Department of Hematology,Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Department of Thoracic Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University, 3Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine,Peking Union Medical College, 4Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences,Wuhan University, 5Department of Gastroenterology,Central Hospital of Wuhan, 6Department of Transfusion,Zhongnan Hospital of Wuhan University
Summary
ZW10 상호 작용 단백질 (ZWINT)은 유사분열 스핀들 체크포인트 및 암종의 병인에 참여합니다. 여기에서, 우리는 인간 적인 폐암 조직에 있는 ZWINT의 면역점의 방법론을 소개하고, 전체 슬라이드 및 심상 분석의 디지털 스캐닝에 선행합니다. 이 방법론은 고품질의 디지털 이미지와 신뢰할 수 있는 결과를 제공할 수 있습니다.
Abstract
이 연구의 목적은 인간 폐 조직의 면역 염색 방법론을 소개하고 전체 슬라이드 디지털 스캐닝 및 이미지 분석을 도입하는 것입니다. 디지털 스캐닝은 슬라이드 스택을 스캔하고 고품질의 디지털 이미지를 생성하는 빠른 방법입니다. 그것은 병리학자에 의해 전통적인 가벼운 현미경 검사법 (CLM)와 일치하는 결과를 생성할 수 있습니다. 또한 디지털 이미지의 가용성을 통해 여러 사람이 동일한 슬라이드를 동시에 관찰할 수 있습니다. 또한 슬라이드의 디지털 이미지를 데이터베이스에 저장할 수 있어 유리 슬라이드의 장기적인 열화를 피할 수 있습니다. 이 기술의 한계는 다음과 같습니다. 첫째, 고품질의 준비 된 조직과 원래의 면역 조직 화학 (IHC) 슬라이드가 손상또는 과도한 밀봉 잔류물없이 필요합니다. 둘째, 종양 또는 비종양 부위는 채점 하는 동안 종양 또는 비 종양 영역에 대한 혼란을 피하기 위해 소프트웨어를 사용하여 분석하기 전에 숙련 된 병리학자가 지정해야합니다. 셋째, 작업자는 전체 슬라이드 이미징에서 디지털화 프로세스 전반에 걸쳐 색상 재현을 제어해야 합니다.
Introduction
ZW10 상호 작용 단백질(ZWINT)은 유사분열 스핀들 체크포인트1,2,3에관여하는 키네토코레 복합체의 필수 성분이다. ZWINT의 고갈은 비정상적인 조기 염색체 분리 1,2,3으로이어진다고 보고되었다. 최근 연구는 ZWINT가 종양 세포의 증식을 촉진하여 다발성 종양의 발병기전에 관여하는 것으로 4,5. 우리는 이전에 폐암에 있는 ZWINT의과발현을 보고했습니다 5. CLM을 이용한 병리학자에 의한 슬라이드 분석은 시간이 많이 소요되고 정량적이지 않다는 것이 널리 받아들여지고있다6,7,8. 또한 저장된 유리 슬라이드의 열화로 인해 이전에 생성된 슬라이드를 철회할 수 없습니다. 컴퓨터 기반의 디지털 전체 슬라이드 이미징(WSI)의 새로운 방법은이러한 한계를 극복할 수 있는 6,7,8.
이를 위해, 우리는 전체 슬라이드 디지털 스캐닝 및 소프트웨어 기반 이미지 분석과 결합된 인간 폐암 조직에서 ZWINT의 면역 염색방법론을 설명합니다. 이 방법론의 주요 장점은 CLM과 일치하는 결과를 생산하는 것입니다. 이 기술은 헤마톡실린-에오신 염색(H&E) 및 IHC, 현자 형질화(FISH), 조직 미세어레이(TMA), 약물 발견 및 개발의 병리학적 채점 분야에서 널리 사용될 수 있다.
Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 우한 대학의 중난 병원과 우한 대학의 인민 병원의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 1. IHC 슬라이드 준비 실온(RT)에서 24시간 동안 인산완충식염수(PBS)에서 4% 파라포름알데히드에 인간 폐 조직 단편(약 3 x 3cm)을 침지하여 폐 조직 샘플을 고정시. 실온에서 각각 80, 95%, 100% 에탄올을 15분, 20분, 20분동안 탈수시한다. 마지막으로, 실온?…
Representative Results
우리는 IHC에 의하여 14개의 편평상피세포 암 (SCC) 및 14선암 (ADC)을 포함하여 비소세포 폐암 (NSCLC) 견본 (종양 및 인접한 비종양 조직)의 28 쌍에서 ZWINT의 발현 수준을 측정했습니다. 슬라이드의 전체 슬라이드 디지털 스캐닝은 고품질의디지털 이미지를 제공했습니다(그림 1A). 결과는 폐암의 H 점수가 인접한 비암 조직(P< 0.0001, 2꼬리 t-시험)보다?…
Discussion
전체 슬라이드 스캐닝은 임상 및 연구 목적으로 고품질 이미지의 강력한 스캐닝 및 생산에 대한 화제가 되고 있습니다11,12,13. 이미지는 분11,12,13이내에 슬라이드 스캐닝 현미경에 의해 생성 될 수있다. 이 방법론을 적용해서, 우리는 ZWINT IHC 슬라이드를 위?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 중국 국립 자연 재단 (81500151, 81400121, 81270607, 81541027 및 81501352)과 후베이성 자연 재단 (2017CFB631 호)에 의해 지원되었습니다. 저자들은 구오진, 창민, 리후이, 그리고 우한 구글 생물학 기술 유한공사의 동료들에게 기술 지원에 감사를 표한다. 저자는 또한 언어 편집 무하마드 자말 감사합니다.
Materials
| Pannoramic MIDI | 3D HISTECH | Cat: PMIDI-040709 | An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more. |
| QuantCenter | 3D HISTECH | Downloaded from the official website of the company | The framework for 3DHISTCH's image analysis applications. |
| LEICA RM2235 | Leica Microsystems | Cat: 14050038604 | The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation. |
| Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody | Abcam | Cat: ab197794 | Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue. |
| Anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Goodbio Technology | Cat:GB23303-1 | Secondary antibody for IHC staining. |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan Goodbio Technology | Cat:G0002 | A solution containing a phosphate buffer. |
| OLYMPUS CX23 | OLYMPUS | Cat:6M87620 | Microscope for detection of H&E or IHC slides. |
| Dimethylbenzene | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent | Cat:1330-20-7 | A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study. |
| Hematoxylin Staining Solution | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1039 | It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue. |
| Tween 20 | Baitg | Cat:2005-64-5 | It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications. |
| Citric acid repair liquid | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1202 | Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure. |
| LEICA ASP200s | Leica | Cat: 14048043626 | It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes. |
| LEICA Arcadia H | Leica | Cat: 14039354103 | It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability. |
| LEICA Arcadia C | Leica | Cat: 14039354102 | It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C. |
| CaseViewer Software | 3DHISTECH |
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Citazione di questo articolo
Wen, Y., Song-ping, X., Pan, L., Xiao-yan, L., Shan, P., Qian, Y., Meng, S., Xiao-xing, H., Rui-jing, X., Jie, X., Qiu-ping, Z., Liang, S. Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues. J. Vis. Exp. (147), e58551, doi:10.3791/58551 (2019).