यहां, हम वर्तमान स्ट्रिंग विधानसभा gRNA क्लोनिंग (STAgR), CRISPR के लिए आसानी से मल्टीप्लेक्स gRNA वैक्टर के लिए एक विधि/Cas9 दृष्टिकोण । STAgR एकुण gRNA division सरल, कार्यक्षम व अनुकूलनीय.
बैक्टीरियल CRISPR/Cas9 प्रणाली के जीवन वैज्ञानिकों के लिए methodological विकल्पों में काफी वृद्धि हुई है । इसके उपयोग के कारण, आनुवंशिक और जीनोमिक इंजीनियरिंग प्रणालियों की एक बड़ी रेंज के लिए लागू हो गया । इसके अलावा, कई transcriptional और epigenomic इंजीनियरिंग दृष्टिकोण अब आम तौर पर पहली बार के लिए व्यवहार्य हैं । CRISPR की व्यापक प्रयोज्यता का एक कारण इसकी द्विपक्षीय प्रकृति में निहित है । छोटे gRNAs जटिल, प्रोटीन Cas9 के वेरिएंट के जीनोमिक लक्ष्य निर्धारित करते हैं, और स्थानीय आणविक परिणाम । हालांकि, कई CRISPR दृष्टिकोण व्यक्तिगत कोशिकाओं में एकाधिक gRNAs के एक साथ वितरण पर निर्भर करते हैं । यहां, हम स्ट्रिंग विधानसभा gRNA क्लोनिंग (STAgR), एक तरीका है कि एक क्लोनिंग कदम में मल्टीप्लेक्स gRNA अभिव्यक्ति वैक्टर के सरल, तेज और कुशल पीढ़ी की अनुमति देता है के लिए एक अनुकूलन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । STAgR लागत प्रभावी है, के बाद से (इस प्रोटोकॉल में) व्यक्तिगत लक्ष्यीकरण दृश्यों कम बदस्तूर प्राइमरों द्वारा पेश कर रहे हैं, जबकि gRNA अभिव्यक्ति कैसेट के लंबे डीएनए टेंपलेट्स फिर से किया जा सकता है कई बार । इसके अलावा, STAgR gRNAs की एक बड़ी संख्या का एक कदम शामिल करने की अनुमति देता है, साथ ही विभिंन gRNA वेरिएंट, वैक्टर और प्रवर्तकों के संयोजन ।
स्ट्रिंग विधानसभा gRNA क्लोनिंग (STAgR) एक एकल क्लोनिंग कदम में एकाधिक gRNA अभिव्यक्ति कैसेट युक्त अभिव्यक्ति वैक्टर के कुशल रातोंरात पीढ़ी को सक्षम करने के लिए एक विधि है । STAgR प्रोटोकॉल विशेषज्ञ विशेषज्ञता या सामग्री पर निर्भर नहीं करता है और अनुकूलन के लिए कई विकल्प प्रदान करता है ।
बैक्टीरियल CRISPR प्रोटीन Cas9 की एक अनोखी क्षमता होती है । यह खोजने के लिए सक्षम है और चुनिंदा ही उन डीएनए स्वाभाविक रूप से उत्पंन crRNAs या1gRNAs इंजीनियर में इनकोडिंग अनुक्रम । एक आणविक उपकरण के रूप में इसके उपयोग के दृष्टिकोण है कि असंभव, साध्य या केवल कुछ सेलुलर मॉडलों तक ही सीमित थे की एक बड़ी संख्या में सक्षम है हाल ही में जब तक । इनमें लक्षित जीन उत्परिवर्तनों2, जीनोम इंजीनियरिंग3, epigenome संपादन4,5,6, transcriptional सक्रियण और जीन मुंह बंद करने7,8शामिल हैं । जहां तक हम जानते है CRISPR सार्वभौमिक रूप से तैनात है, इसके आवेदन की रिपोर्ट के रूप में लक्ष्य साइटों, सेल प्रकार और प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए मौजूद हैं । हालांकि, कई CRISPR अनुप्रयोगों जीनोमिक जोड़तोड़ (अनुवादन9,10, मध्यम11 और बड़े पैमाने जीनोमिक परिवर्तन की एक श्रृंखला सहित एकाधिक gRNAs की डिलीवरी पर प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से निर्भर 12 , 13), जीनोम इंजीनियरिंग (Cas9 nickases14, सशर्त alleles11,15 या धारावाहिक उत्परिवर्तनों16की पीढ़ी का उपयोग करें) और17रणनीतियों अनुरेखण । इसके अलावा, अंय दृष्टिकोण के लिए (transcriptional इंजीनियरिंग18, epigenome इंजीनियरिंग19,20) एकाधिक लक्ष्यीकरण साइटों को सख्ती से अनिवार्य नहीं हैं, लेकिन वे अपनी अधिकतम प्रभाव तक पहुंचने अक्सर केवल इस के तहत हालत.
कई उपयोगी तरीकों को उत्पंन करने के लिए वर्णित किया गया है gRNA वैक्टर एक से अधिक gRNA अभिव्यक्ति कैसेट युक्त21,22,23,24,25,26, 27. यहां, हम STAgR, स्ट्रिंग विधानसभा gRNA क्लोनिंग, जो सादगी और गति के अपने संयोजन में बकाया है के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद (केवल एक रातोंरात क्लोनिंग कदम की जरूरत है), कम लागत (के रूप में डीएनए टेंपलेट्स कई बार reused किया जा सकता है), अनुकूलन (के लिए विभिंन gRNA प्रणालियों और प्रमोटरों) और प्रभावशीलता (यह gRNA कैसेट की उच्च संख्या से युक्त वैक्टर की पीढ़ी की अनुमति देता है)28।
STAgR सिद्धांत में कुछ (1-2 gRNAs), कई (3-5 gRNAs) और अभिव्यक्ति कैसेट की सबसे अधिक संख्या में से कुछ के साथ अभिव्यक्ति वैक्टर उत्पंन किया जा सकता है अब तक (6-8 gRNAs)28की सूचना दी । इसी तरह, STAgR किसी भी gRNA अनुक्रम, रीढ़ या प्रमोटर के लिए लागू होता है । हालांकि, STAgR मुख्य रूप से पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रियाओं (पीसीआर) और गिब्सन विधानसभा पर आधारित है, उच्च अनुक्रम समानता के साथ gRNAs एक वैकल्पिक पद्धति का उपयोग कर उत्पंन किया जाना चाहिए ।
यहां हम STAgR के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान gRNA अभिव्यक्ति की तेजी और सरल पीढ़ी अलग आकार के plasmids की अनुमति । इस प्रोटोकॉल gRNA plasmids की एक कदम पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ 2 – 8 gRNA अभिव्यक्ति कैसेट (के साथ या बिना दो MS2 आरएनए aptamers) gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर STAgR_Neo में, और मानव U6 का उपयोग, माउस U6, मानव 7sK और मानव H1 प्रवर्तक28 ,३२,३३. यदि चार से अधिक कैसेट वांछित हैं, यह क्षमता बढ़ाने के लिए कम से कम दो अलग प्रमोटर/पाड़ प्रकार का उपयोग करने की सिफारिश की है । अंय वैक्टर, प्रवर्तकों और प्रमोटर संयोजन के रूप में अच्छी तरह से अधिक से अधिक 8 gRNA कैसेट के रूप में अच्छी तरह से संभव हो सकता है; हालांकि, इस पर जांच नहीं की गई है । हालांकि हमारे अनुभव में विधि मज़बूती से काम करता है और reproducibly, हम महत्वपूर्ण कदम निर्धारित किया है और समस्या निवारण रणनीतियों अपेक्षित परिणाम तुरंत नहीं होने चाहिए । हमारे अनुभव में कुछ कदम दृष्टिकोण की सफलता के लिए निर्णायक हैं: और सबसे पहले, यह गिब्सन विधानसभा कदम (3:1) में वेक्टर रीढ़ आवेषण के सही दाढ़ अनुपात का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । लेकिन, हमने देखा है कि कुछ gRNA के लिए आवेषण के एक 1:1 अनुपात सेट के लिए वेक्टर लाभप्रद है, यहां तक कि जब gRNA कैसेट संख्या दो से अधिक है । दूसरे, गिब्सन विधानसभा प्रतिक्रिया की अवधि पर्याप्त रूप से लंबा होना चाहिए (कम से कम ४५ मिनट की सिफारिश की) ।
STAgR संशोधनों की एक बड़ी संख्या के साथ नियोजित किया जा सकता है । लक्ष्यीकरण अनुक्रम, gRNA संख्या और पाड़, प्रवर्तकों और वेक्टर रीढ़ की और अनुकूलित किया जा सकता है स्वतंत्र रूप से संयुक्त । हालांकि, प्रत्येक संयोजन थोड़ा अलग आवश्यकताओं हो सकता है । हमारे अनुभव में, यदि मध्यम या gRNA कैसेट (> 4) के उच्च संख्या वांछित हैं, लेकिन तुरंत प्राप्त नहीं है, आमतौर पर सबसे तेजी से इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए वेक्टर में व्यक्तिगत gRNA कैसेट का क्रम बदल रहा है । इसी तरह, अलग gRNA प्रवर्तकों और पाड़ों के संयोजन दक्षता में सुधार (और इस प्रकार कॉलोनी पीसीआर की आवश्यकता संख्या है कि रन बनाए है कम करती है) जब कई gRNA कैसेट क्लोन कर रहे हैं । हमने पाया है कि गलत क्लोन आमतौर पर गिब्सन विधानसभा के दौरान दोहराया दृश्यों का सहज संयोजन के द्वारा उत्पंन कर रहे हैं । हालांकि इस विधि की क्षमता को कम कर सकते हैं, यह भी कार्यात्मक gRNA के साथ वैक्टर के एक साथ पीढ़ी में परिणाम28सेट ।
एक से अधिक gRNA अभिव्यक्ति कैसेट युक्त मल्टीप्लेक्सिंग gRNA वैक्टर की पीढ़ी के विभिंन तरीकों की एक संख्या के साथ सूचित किया गया है21,22,23,24,25, २६,२७. जबकि कुछ एक साथ या gRNA जोड़े22,३४के अनुक्रमिक क्लोनिंग रोजगार, दूसरों गोल्डन गेट विधानसभा और कई अनुक्रमिक क्लोनिंग कदम25,३५पर निर्भर करते हैं । एक विशेष दृष्टिकोण Xie एट अलद्वारा इस्तेमाल किया गया है, अंतर्जात सेलुलर tRNA प्रसंस्करण प्रणाली को रोजगार के लिए कई gRNAs एक जनक प्रतिलिपि३६से बाहर कटौती । इस विधि का advangetage केवल एक प्रवर्तक की आवश्यकता है; दोष प्रत्येक gRNA संयोजन के लिए नए संश्लेषित डीएनए टुकड़े की जरूरत है । प्रत्येक gRNA division कृती ही फायदे आणि नुकसान होते; STAgR कम लागत के साथ दक्षता, संभव gRNA कैसेट की उच्च संख्या के साथ सादगी को जोड़ती है ।
STAgR (और अंय मल्टीप्लेक्सिंग प्रणालियों) की संभावना को सक्षम करने में सहायक होगा कुशल (और एक साथ) vivo मेंकई जीन के विघटन, के रूप में zebrafish दिमाग में अग्रणी28। gRNA मल्टीप्लेक्सिंग वैक्टर के एक अंय भविष्य के आवेदन में एक जीन की प्रेरण या दमन के विपरीत पूरा transcriptional कार्यक्रमों में हेरफेर के लिए वादा है । संभावना है, इन तरीकों से यह संभव है की तुलना में एक बहुत अधिक डिग्री करने के लिए होगा पर कोशिकाओं और अंगों को बदलने की अनुमति देगा ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक प्रो डॉ स्टीफ़न बेक और प्रो डॉ Jovica Ninkovic उनके इनपुट, मदद और STAgR विधि के विकास में समर्थन के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । टोबीस Klötzer, अण्णा Köferle आणि वैलेंटिन Baumann उपयोगी टिपण्णी लिए. काम DFG (STR 1385/1-1) द्वारा समर्थित किया गया है ।
Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
Agarose | VWR | 443666A | |
DpnI | NEB | R0176S | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
DNA Ladder 1kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |